唐菖蒲響應電子束轉靶X射線輻照的生物學效應和輻射敏感性評價

黎熠睿 王 丹 湛曉蝶 許程航 徐龍水 鄧善文 陳 浩

(1 西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621000；2 四川省輻射誘變技術育種平臺，四川 成都 610000；3 四川省原子能研究院，四川 成都 610000；4 西南科技大學 國防科工委核廢物和環境安全國防重點學科實驗室，四川 綿陽 621000)

唐菖蒲(Gladiolusgandavensis)為鳶尾科唐菖蒲屬多年生草本花卉，具有極強的觀賞性，是重要的鮮切花生產材料，市場需求量逐年增加[1]。但目前，全球唐菖蒲新品種數量和種球質量明顯下降，因此，唐菖蒲新品種的選育具有重要意義[2]。

研究表明，利用X射線、γ射線、中子等輻射處理能明顯改善植物的多種農藝性狀[3-5]。同時，電離輻射具有強穿透力[6]，能增加遺傳多樣性[7]、引入隨機性可遺傳變異[8-9]等特點，在觀賞植物中應用廣泛，是有效的改良方式[10]。有研究發現，經輻射處理的植株易發生花和葉的顏色、形狀、大小和生長習性等表型特征的變化[11]。近年來，已有關于唐菖蒲輻射誘變育種的研究報道，如喬勇[12]通過60Co-γ射線輻射唐菖蒲誘變出4種花色和葉色變異植株；張志偉等[13]證明電子束輻射可用于唐菖蒲新品種培育；Patil等[14]通過γ射線輻射唐菖蒲獲得1個穗型突變體和3種花色變異株。可見，輻射誘變育種技術已成為觀賞性強的花卉品種選育和性狀改良的重要技術[15-16]。

電子束轉靶X射線是一種新型的輻射誘變技術，是高能電子束轟擊重金屬驟然減速產生的韌致輻射X射線[17]，其通過輻射可對生物體細胞產生直接和間接的生物學損傷效應[18]，且損傷類型多樣。該方法可有效利用電子加速器，具有劑量準確、加工快、無放射源等優點，有效解決了電子束輻照穿透力弱的劣勢[19]，在物理、材料、食品等領域[20]已有相關研究報道，但在觀賞植物育種中尚鮮見報道。本研究系統地分析了X射線對唐菖蒲的輻射生物學效應，以期為唐菖蒲新品種選育和觀賞性狀改良提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

唐菖蒲種球(購于四川貝拉園藝有限公司)，無病蟲害，種球直徑均在2.8～3.2 cm之間，品種分別為道蘭(Dowland)、柏遼茲(Berlioz)、貝多芬(Beethoven)、湖岸(Lakeland)、白色昌盛(White prosper)。

1.2 方法

1.2.1 輻射處理 在四川省原子能研究院開展電子束轉靶X射線(以下簡稱X射線)輻射處理，輻射劑量分別為0(CK)、25、50、75、100 Gy，能量為2 MeV，流速為10 mA，每個品種各輻射劑量分別處理14個種球，每處理均設3次生物學重復，輻射處理完成后進行盆栽試驗。

1.2.2 栽培管理 按照裂區隨機區組試驗盆栽擺放要求，采用長40 cm、寬14 cm、高17 cm的方形塑料花盆栽種，每盆種植7個相同品種的唐菖蒲種球。采用營養土體積配比為植物栽培專用土∶發酵有機基質∶腐葉土∶蛭石=5∶2∶2∶1，拌土時加入多菌靈；二葉期、三葉期、花芽分化前后分別追加復合肥1次，每盆施加復合肥10 g。M0種球(母球)生長的植株限定為VM1；VM1種球完成一個生長周期，分別收集母球和子球，子球栽種后生長的植株為VM2。統計唐菖蒲各品種VM1、VM2種球經不同輻射處理后的發芽率，測定VM1、VM2植株的生長指標。

1.2.3 發芽率及生長指標的測定 VM1、VM2不同唐菖蒲種球，均栽種30 d后開始檢測數據，測定時將種球萌發露白或芽已轉綠即視作發芽，統計并計算發芽率和種球繁殖率：

發芽率=出芽種球數/總種球數×100%

(1)

種球繁殖率=VM2種球數/VM1種球數×100%

(2) 。

出芽生長60 d后開始測定每組植株的生長指標(VM1測量各處理所有存活植株，VM2各處理隨機選取3株測量)。統計并計算VM1、VM2的變異率：

變異率=變異植株數/總存活植株數×100%

(3) 。

各變異類型植株隨機選取3株進行葉綠素檢測、葉片微觀觀察等。開花后，統計或檢測各品種單株開花數、花單朵直徑、花莖長、花序長、花粉形態等性狀。具體測定方法如下：

采用精確度為0.01 mm的BS153015電子數顯卡尺 (寧波世際波斯工具公司)測量VM2種球最大直徑；株高為植株頂部至土表的垂直距離；參照石景蓀等[21]的唐菖蒲葉面積測定法，測定葉片長、寬值，構建葉面積回歸方程，計算植株總葉面積；去除葉片尖部與基部，參照王學奎等[22]的方法，利用UV8000s紫外分光光度計(上海元析儀器公司)測定葉片葉綠素含量；采用EVO18掃描電鏡(德國蔡司儀器公司)進行葉片表面形態觀察，打孔法采樣，取變異植株葉片中部位置，冷凍干燥12 h，噴金后測樣；采用EVO18掃描電鏡取未開放的VM2植株花蕾花粉進行花粉掃描電鏡觀察，冷凍干燥12 h，噴金后測樣；以花瓣露出花被為標準計數，統計單株開花數；以左右兩側對稱花瓣的總長為花朵直徑，用直尺測量花徑長；以花序頂部至最后一片葉片分叉處為花莖，用直尺測量花莖長；以花序頂部至下部最后一朵花的基部為花序長度，用直尺測量花序長度。

1.2.4 半致死劑量計算 半致死劑量的計算方法參照王靜等[23]和周亞倩等[24]的方法，根據統計出的發芽率構建半致死劑量回歸方程。不同品種唐菖蒲分別以電子束轉靶X射線輻射劑量為橫坐標，發芽率為縱坐標擬合y=ax+b的線性方程，計算發芽率為50%時的輻射劑量，從而確定半致死劑量。

1.3 數據分析

采用SPSS 23.0、Origin 9.0、Microsoft Excel 2010等軟件對數據進行分析，數據均為3次重復的平均值。

2 結果與分析

2.1 X射線輻射對唐菖蒲種球的影響

2.1.1 不同輻射處理對VM2種球繁殖率的影響 由表1可知，經X射線輻射后，各輻射處理的道蘭、湖岸、柏遼茲繁殖率均顯著高于CK，且均在25 Gy處理時種球的繁殖率最高，分別較CK高23.81、16.67、24.01個百分點，繼續增大輻射劑量，3個品種的繁殖率均降低，但仍高于CK，表明25～100 Gy的電子束轉靶X射線輻射處理對唐菖蒲種球的繁殖有促進作用。25 Gy和75 Gy處理時的貝多芬種球繁殖率均顯著高于CK，50 Gy和100 Gy處理時種球繁殖率也高于CK，但差異不顯著。白色昌盛繁殖率與輻射劑量呈負相關，50～100 Gy處理顯著低于CK，100 Gy處理時繁殖率降至58.10%。

表1 X射線輻射對不同品種唐菖蒲VM2種球繁殖率的影響Table 1 Effects of X-ray radiation on the breeding rate of VM2 gladiolus bulb of different varieties /%

注：同列不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.

2.1.2 不同輻射處理對VM2種球直徑的影響 由表2可知，25～50 Gy處理下，各品種的VM2種球直徑均大于CK。25 Gy處理下，道蘭、湖岸、柏遼茲、白色昌盛和貝多芬的VM2種球直徑均達到最大值，分別為34.41、32.86、39.08、32.64和41.18 mm，且顯著高于CK，表明低劑量的X射線輻射處理可有效增加唐菖蒲種球的球徑。75～100 Gy處理下，湖岸、柏遼茲和白色昌盛的VM2種球直徑顯著低于CK，表現出明顯的輻射損傷效應，且100 Gy處理的VM2種球直徑最小；道蘭、柏遼茲和貝多芬在75 Gy和100 Gy劑量處理間差異不顯著，表明X射線達到一定閾值后抑制效應會減弱或趨于穩定。

表2 X射線輻射對不同品種唐菖薄VM2種球直徑的影響Table 2 Effects of X-ray radiation on the diameter of VM2 gladiolus bulb of different varieties /mm

2.2 X射線輻射對唐菖蒲生長的影響

2.2.1 不同輻射處理對VM1、VM2發芽率的影響 由表3可知，經X射線輻射后，與CK相比，不同輻射處理對5個品種唐菖蒲VM1的發芽率均無顯著影響，且各輻射處理下唐菖蒲VM1的發芽率均較高；輻射處理對唐菖蒲VM2發芽率的延續性影響較大，各輻射處理間差異顯著。25 Gy處理下，道蘭、湖岸、柏遼茲、白色昌盛和貝多芬VM2的發芽率均達到最大值，分別為96.33%、86.96%、93.78%、87.33%、97.52%，且顯著高于其他處理，說明25 Gy處理對唐菖蒲VM2發芽率具有明顯的促進作用，且該作用從VM1延續至VM2；50～100 Gy處理下，隨著輻射劑量的增加，各品種VM2的發芽率均逐漸降低，在100 Gy處理時達到最小值，表明X射線的輻射損傷效應具有滯后性。湖岸和白色昌盛VM2的發芽率在50 Gy處理時，達到半致死劑量；道蘭、柏遼茲、貝多芬VM2的發芽率在75～100 Gy之間可導致半致死。對輻射劑量與VM2的發芽率進行相關性回歸分析，預測半致死劑量，結果表明，道蘭、湖岸、柏遼茲、白色昌盛和貝多芬VM2發芽率的半致死劑量分別為78.00、48.24、87.07、47.69和86.81 Gy。由此可知，5個品種對X射線的輻射敏感性由弱到強依次為柏遼茲<貝多芬<道蘭<湖岸<白色昌盛。

2.2.2 不同輻射處理對VM1、VM2株高與葉面積的影響 由圖1-A、B可知，不同輻射處理下，不同唐菖蒲品種VM1、VM2的生物學效應存在差異，但總體上均表現出低促高抑的現象。25～50 Gy處理對湖岸、柏遼茲和貝多芬3個品種VM2株高有顯著促進作用(P<0.05)，50 Gy處理后略有下降，但25 Gy和50 Gy處理間差異不大，而后隨著輻射劑量的增加，VM2株高均逐漸降低，而湖岸在 100 Gy 處理時的株高仍略高于CK，但與CK差異不顯著(P>0.05)，貝多芬在100 Gy處理時的株高略高于75 Gy，但處理間差異不顯著(P>0.05)。道蘭VM1在50 Gy處理時株高達到最大值，為60.37 cm，隨后株高逐漸降低，但在100 Gy處理時株高與CK差異不顯著，說明低于100 Gy的X射線輻射可促進道蘭的生長，其中，50 Gy處理效果最佳。白色昌盛VM1的株高與輻射劑量呈負相關，劑量越高抑制越嚴重，其輻射耐受性較低。與唐菖蒲VM1的株高相比，不同品種VM2植株的株高在同一劑量處理下均有所降低。湖岸、柏遼茲和貝多芬VM2植株在25 Gy處理時株高達到最高，道蘭和白色昌盛VM2植株在50 Gy處理達到最高，100 Gy處理時唐菖蒲VM2的株高受抑制程度增加。

圖1 X射線輻射對不同唐菖蒲品種VM1、VM2株高和葉面積的影響Fig.1 Effects of X-ray radiation on VM1 and VM2 plant height and leaf area of different gladiolus varieties

由圖1-C、D可知，不同品種VM1、VM2的葉面積變化趨勢相同，除白色昌盛VM1在50 Gy處理時達到最高，其余4個品種在25 Gy處理時達到最大值；5個品種在100 Gy時均最小，且VM2輻射損傷表現出來的抑制作用更加明顯，道蘭、湖岸、柏遼茲、白色昌盛和貝多芬VM2的葉面積較VM1分別減少11.65、47.93、60.17、137.74、42.47 cm2。上述研究表明，高劑量輻射處理對植株的抑制作用具有延續性。

2.3 X射線輻射對VM2葉形態及葉色變化的影響

2.3.1 不同輻射處理對VM2葉片形態的影響 由圖2可知，經50～100 Gy處理后的植株易發生形態變化。以湖岸、柏遼茲和貝多芬為例，50～100 Gy處理后，湖岸和柏遼茲發生了較明顯的葉色變異，主要表現為葉片呈嫩黃色或黃綠相間、植株基部葉片短小且互相套迭、葉片相互粘連呈錐形、芽狀苗(始終保持苗期的植株形態)。湖岸葉片形態變化主要集中在50～75 Gy處理，柏遼茲主要發生于50～100 Gy處理，貝多芬經75 Gy處理后株型變化較為明顯，說明不同品種唐菖蒲的植株形態變化主要出現在VM2，證明X射線的輻射生物學效應具有滯后性。

注：a:湖岸葉片短小且互相套迭(75 Gy)； b：湖岸葉黃色(50 Gy)；c:柏遼茲葉黃綠條紋(50 Gy)；d:柏遼茲芽狀苗(100 Gy)；e:貝多芬葉連呈錐形(75 Gy)。Note: a:The blade of the Lakeland is short and overlapping with each other(75 Gy). b: Yellow leaf of Lakeland (50 Gy).c: Yellow-green stripe of Berlioz leaf (50 Gy). d: Berlioz bulb is like bud(100 Gy). e: Beethoven leaf becomes cones(75 Gy).圖2 X射線照射下唐菖蒲VM2突變體植株形態變化Fig.2 Plant morphology of gladiolus mutants in VM2 under X-ray irradiation

注：a：湖岸對照；a1、a2：湖岸變異植株；b：柏遼茲對照；b1、b2：柏遼茲變異植株；c：貝多芬對照；c1：貝多芬變異植株。Note:a: Lakeland control. a1,a2: Lakeland variant: b: Berlioz control. b1,b2: Berlioz variant. c:Beethoven control. c1: Beethoven variant.圖3 VM2變異植株葉片掃描電鏡微觀圖Fig.3 Scanning Electron Microscopy of the leaves of VM2 variant plants

利用掃描電鏡進一步探討導致葉片發生形態變化的原因，觀察發現湖岸的葉片表面凸起消失(圖3-a1)，凸起間的溝壑變淺(圖3-a2)，氣孔形態由長方形變為橢圓形；柏遼茲和貝多芬葉面凸起逐漸平滑(圖3-b1、c1)且形狀發生不規則變化(圖3-b2)，部分氣孔形態由長方形逐漸轉變為正方形(圖3-b1、b2)。

2.3.2 不同輻射處理對VM2葉色變化的影響 針對圖2發現的5種唐菖蒲VM2突變體植株形態變化(葉色黃綠相間、葉片黃化、葉節間縮短套疊、葉間粘黏、芽狀苗)，每個品種均取3株長勢一致的唐菖蒲VM2突變體植株進行葉綠素含量檢測。由表4可知，變異植株主要集中在50～100 Gy處理，且葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均低于CK，葉黃綠相間的植株葉綠素a+b含量為0.427 mg·g-1，芽狀苗變異植株葉片的葉綠素a+b含量為0.603 mg·g-1，葉節間縮短變異植株葉片的葉綠素a+b含量為1.031 mg·g-1，葉粘黏變異植株葉片的葉綠素a+b含量為0.868 mg·g-1，葉片黃化變異植株葉片的葉綠素a+b含量僅為0.287 mg·g-1，明顯低于CK。表明高劑量(50～100 Gy)的X射線輻射損傷效應在VM2發生且表現明顯。

2.4 X射線輻射對VM2唐菖蒲開花的影響

2.4.1 不同輻射處理對VM2開花性狀的影響 由表5可知，經X射線輻射處理后的唐菖蒲VM2中僅道蘭和柏遼茲的CK和25 Gy處理開花，其余處理均未開花。25 Gy處理后道蘭和柏遼茲的開花性狀均優于CK，花朵數分別增加2、3朵，花直徑分別增加3.26、2.53 cm，花莖增加9.12、37.46 cm，花序長分別增加9.07、25.76 cm，主要表現為花朵數增加、花大莖長。

2.4.2 不同輻射處理對VM2花粉微觀形態的影響 由圖4可知，正常情況下，唐菖蒲的花粉粒表面光滑且呈飽滿球形(圖4-a、b)，而經X輻射處理后的VM2開花植株花粉粒出現表皮破裂(圖4-a1、b2)、中空(圖4-b1、a2)、干癟(圖4-a3、b3)等現象。說明X射線輻射會破壞其基本形態，對花粉粒造成不可逆的生物學損傷。

表4 X射線輻射后唐菖蒲變異植株的葉綠素檢測Table 4 Detection of chlorophyll in gladiolus mutated plants after X-ray irradiation

注：“-”表示無。

Note:‘-’ means none.

表5 X射線輻射后唐菖蒲VM2的開花性狀Table 5 Statistics of flowering characters of VM2 gladiolus after X-ray irradiation

注：a：道蘭對照；a1,a2,a3：道蘭25 Gy處理下開花植株花粉；b：柏遼茲對照；b1,b2,b3：柏遼茲25 Gy處理下開花植株花粉。Note: a: Dowland control. a1,a2,a3: Pollen of flowering plants of Dowland treated with 25 Gy.b:Berlioz control. b1,b2,b3: Pollen of flowering plants of Berlioz treated with 25 Gy.圖4 唐菖蒲VM2花粉粒掃描電鏡微觀圖Fig.4 Scanning electron microscopy of pollen grains of VM2 gladiolus

3 討論

輻射誘變育種具有操作方法簡便、突變率高、育種年限短等優點[7]。本研究首次將電子束轉靶X射線運用于唐菖蒲輻射育種中，通過對VM1、VM2植株各指標的檢測發現，電子束轉靶X射線能明顯影響唐菖蒲VM2種球的繁殖率、種球直徑等，且表現為低劑量(25 Gy)輻射處理有益于種球繁殖、球莖膨大、種球發芽，高劑量(75～100 Gy)輻射處理后種球膨大和發芽均受到抑制。Cammaerts等[25]研究表明，低劑量輻射處理可以有效打破十字花科種子休眠，促進種子萌發，高于某個輻射閾值后，發芽率隨輻射劑量的增加而逐漸降低，或出現種子發芽滯后的現象，這與本研究結果一致。本試驗中VM1種球發芽率受輻射影響不明顯，VM2種球的發芽率在25 Gy處理時的發芽率顯著高于對照，50～100 Gy時發芽受抑制明顯，說明電子束轉靶X射線輻射后的生物效應存在潛伏期和滯后性，且劑量越高，致死現象越嚴重，與Jan等[26]的研究結果一致，且該現象可能與輻射劑量和生物體的內在輻射敏感性相關[27]。

輻射敏感性是指輻射對物體的可識別效應的數量，是細胞代謝活力的表現，與植物的營養狀況存在一定的關系[28]，其中半致死劑量是衡量植物對輻射敏感性的重要指標。大量研究表明，半致死劑量可以通過根系生長情況[29]、存活率[23]、萌發率[24]等指標測定。本研究以唐菖蒲VM2種球發芽率作為半致死劑量檢測指標，通過建立半致死劑量回歸方程得出道蘭、湖岸、柏遼茲、白色昌盛和貝多芬5個品種的半致死劑量分別為78.00、48.24、87.07、47.69和86.81 Gy，即5個品種對電子束轉靶X射線的輻射敏感性最弱為柏遼茲，最強為白色昌盛，表明輻射敏感性因品種、組織器官、生長階段等的不同而存在差異，與前人研究一致[30-31]。此外，任少雄等[32]提出誘變育種的最適劑量與半致死劑量接近，本研究雖已找出5個唐菖蒲品種在X射線輻射下的半致死劑量，但各品種的半致死劑量是否是電子束轉靶X射線輻射的最適劑量還需進一步研究。

研究表明，低劑量輻射處理可促進種子的萌發[33]，增強植株抗逆性[34-35]，提高植株的生長發育能力[36]等。本研究發現，經25 Gy X射線輻射處理后，VM1、VM2種球萌發和植株生長狀態良好，且VM2開花植株開花性狀優于對照，表現為花大、花數多、花序長，說明低劑量的X射線輻射可以作為改良物種的一種途徑，這與Singh等[37]的研究結果一致。

此外，本研究還發現50～100 Gy電子束轉靶X射線對植物的生長有致死效應，高劑量輻射處理后的VM2植株的生長情況明顯較VM1植株差，表現出明顯的輻射損傷滯后現象；同時，在該輻射區間內VM2植株出現較多的形態變異，說明適宜的輻射劑量能夠誘發更多的變異，這與李風童等[38]的研究結果一致。本研究對5種不同形態的變異植株進行葉片微觀形態和葉綠素含量檢測，發現經輻射處理后的VM2葉片表面的凸起和氣孔形狀改變，植株葉綠素含量降低，從而推測產生變異的原因可能是經X射線輻射處理后，植株葉綠素、淀粉和蔗糖代謝受到干擾，新生細胞缺少可供營養造成的[39]，也可能是X射線輻射對植物細胞產生的損傷效應導致唐菖蒲葉型或株型的變異[40-42]。但具體的結論還有待進一步深入研究。

4 結論

本研究結果表明，25 Gy輻射處理有利于唐菖蒲VM2種球的萌發和膨大，能促進VM1、VM2植株的生長，可以作為改良唐菖蒲性狀的方法。高輻射劑量(75～100 Gy)處理下，唐菖蒲各品種種球大小、繁殖率、發芽率、株高、葉面積等明顯被抑制，且電子束轉靶X射線輻射生物學效應具有滯后性。綜合唐菖蒲各品種的半致死劑量和生長情況，得出輻射敏感性由弱到強依次為柏遼茲<貝多芬<道蘭<湖岸<白色昌盛。本研究結果為唐菖蒲利用輻射誘變選育優良新品種提供了一定的理論依據。