漂浮型和定生型銅藻中色素的液質聯用分析

張 恒 趙 倩 陳娟娟 朱 旗 吳小凱 駱其君 楊 銳 陳海敏

(1 寧波大學海洋學院，浙江省海洋生物工程重點實驗室，浙江 寧波 315211；2 寧波大學李達三葉耀珍伉儷李本俊海洋生物醫藥研究中心，浙江 寧波 315211)

銅藻(Sargassumhorneri)屬褐藻門(Phaeophyta)墨角藻目(Fucales)馬尾藻屬(SargassumC. Agardh)[1]，主要分布于我國遼寧(大連、金縣)、浙江(中街山列島、嵊泗群島)、福建(平潭、莆田廈門、漳浦、東山島)，以及廣東(惠來、饒平、南澳、海豐)等地[2]。銅藻生長快速，藻體片段可再生長，并具有大面積漂浮生長的特點，是海藻場構建的主要褐藻之一[3]，可為其他生物提供棲息、避敵和繁殖的場所。此外，銅藻是藻膠工業的重要原料，富含多種有益物質，已被廣泛應用到醫學、食品、飼料和有機肥料方面，商品價值較高[4]。近年來，銅藻爆發性增殖的現象時有發生[5]，不僅可能阻塞相應水域航道，而且當藻體大量解體后也能使局部海域水體富營養化，爆發赤潮等一系列生態環境問題。此外，氣候變化以及淺海海水污染加劇等導致銅藻種群數量和棲息空間受到嚴重影響。眾所周知，光強、紫外輻射、溫度、CO2等環境因素對銅藻的生長漂浮起到了重要作用。研究發現，高光強刺激下的銅藻相對生長速度為低光強刺激下的2.1倍；高濃度CO2能促進銅藻的生長，為低濃度CO2培養條件下的1.16倍。此外，高光強和高濃度CO2培養條件下的銅藻中葉綠素a含量低于低光強和低濃度CO2培養條件。UV-A可提高藻體的葉綠素a、類胡蘿卜素含量，而UV-B輻射抑制了銅藻色素的合成[6-7]。綜上，銅藻的生長狀態與色素含量間存在一定關聯，但僅停留在利用分光光度法觀察葉綠素a和類胡蘿卜素總量的變化層面，未明確具體類胡蘿卜素種類，缺乏系統性的研究。

植物色素是藻類合成光合產物的重要集光色素，種類繁多。葉綠素和類胡蘿卜素廣泛存在于各種植物中，是植物體中具有重要生理功能的天然色素，與藻類的生長具有直接相關性。葉綠素是植物葉綠體內參與光合作用的重要色素，其功能是捕獲光能并驅動電子轉移到反應中心[8]。類胡蘿卜素是一類自然界中廣泛存在的有色物質，可根據其化學結構分為胡蘿卜素和葉黃素兩大類，主要存在于海洋微藻和褐藻中。研究表明，類胡蘿卜素在調控細胞增殖分化、基因表達、信號傳導和細胞間隙連接通訊、機體抗氧化和免疫等方面有重要作用[9]。因此，以與生長狀態相關的光合色素為切入點，系統分析銅藻色素分布規律，有助于了解銅藻生長漂浮機制。目前，色素的檢測方法主要有光譜法[10-11]、毛細管電泳法[12-13]、氣相色譜法[14-15]、高效液相色譜法[16-18]、液相色譜-質譜聯用法[19-23]、氣相色譜-質譜聯用法[24-25]等。其中液相色譜-質譜聯用技術結合色譜的高分離能力和質譜的高選擇性、高靈敏度，能夠提供相對分子質量與結構信息，已成為分析復雜微量成分的主流技術。本研究在已報道的5種色素分析方法基礎上[26]，采用高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜(high performance liquid chromactography coupled with triple quadrupole tandem mass spectrometry, HPLC-QqQ-MS)技術建立銅藻巖藻黃素、角黃素、玉米黃質、葉黃素、葉綠素a、葉綠素b、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、ε-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素和ζ-胡蘿卜素11種色素的定量分析方法，并對不同產地、生態型及部位的銅藻進行色素種類和含量分析，比較銅藻中色素的分布特征，以期為進一步深入研究銅藻的漂浮生長機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

標準品：α-胡蘿卜素(純度>97%)、γ-胡蘿卜素(純度>96%)、ε-胡蘿卜素(純度>98%)、ζ-胡蘿卜素(純度>98%)，均購自上海西寶科技有限公司；β-胡蘿卜素(純度>95%)、葉綠素a(純度>95%)、葉綠素b(純度>90%)、葉黃素(純度>75%)、巖藻黃素(純度>95%)、玉米黃質(純度>95%)及角黃素(純度>95%)均購自美國Sigma-Aldrich公司。

甲醇、乙腈，均為HPLC級，購自美國Sigma-Aldrich公司；丙酮(HPLC級)，購自國藥集團化學試劑有限公司；甲酸(HPLC級)，購自美國Sigma-Aldrich公司；乙酸銨(HPLC級)，購自美國TEDIA公司。

TSQ Quantum Access液相色譜三重四級桿質譜聯用系統，美國Thermo Fisher Scientific公司；Cascada Ⅱ.Ⅰ超純水系統，美國Pall公司； Discovery C16氨基色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm粒徑，180?孔徑)，美國Supelco公司。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取11種色素標準品各1.0 mg，分別用100%丙酮溶解并置于2 mL棕色容量瓶中，配置成1 mg·mL-1標準儲備液，于-80℃冰箱保存備用。繪制工作曲線時，用甲醇將儲備液稀釋成不同濃度的標準溶液。

1.3 樣品采集

于2017年2月21分別采集山東青島(36°02′41″ N，120°21′25″ E)、日照(35°22′19″ N，119°36′04″ E)和威海(37°18′22″ N，22°34′48″ E)，以及江蘇南通(33°14′02″ N，121°03′32″ E)的漂浮型銅藻；于2017年3月24日分別采集浙江東極島(30°11′24″ N,122°40′02″ E)的漂浮型銅藻和定生型銅藻。此外，將東極島漂浮型銅藻和定生型銅藻進行部位分類，分別收集莖、葉和氣囊部位。將采集的不同地點、生態型和部位的銅藻立即冷凍干燥48 h后，分別用液氮研磨成粉末并裝在塑封袋中，于-20℃冰箱保存備用。

1.4 色素的提取

分別稱取0.2 g不同地區、生態型和部位的銅藻樣品，置于10 mL棕色離心管中，加入1.8 mL冷丙酮后在冰浴中超聲2 min，以防止丙酮揮發。然后加入0.2 mL超純水，置于-20℃冰箱中靜置，過夜提取。第2天，樣品采用12 000 r·min-1的轉速離心10 min，取上清液，并用聚四氟乙烯(poly tetra fluoroethylene, PTFE)濾膜針筒過濾器過濾[27]。每個樣品設3次平行(所有操作均在暗室中的冰盒上進行)，處理后的樣品在48 h內完成上樣分析[28]。

1.5 高效液相色譜-質譜條件

色譜條件：Supelco Discovery C16氨基色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)。流動相為：甲醇(A)、乙腈(B)和0.1%甲酸水溶液(C)，流速為1.0 mL·min-1。梯度洗脫程序[23]：0～7 min，由80%A+20%C至8%A+72%B+20%C；7～11 min，5%A+77%B+18%C；11～19 min，13%A+85%B+2%C；19～30 min，20%A+80%B；30～34 min，40%A+60%B；34～36 min，80%A+20%C；保持4 min，洗脫總時間為40 min。檢測波長為400～550 nm。進樣量為10 μL。

質譜條件：采用大氣壓化學電離源(APCI)模式。設置噴霧電壓2 500 Ⅴ，鞘氣(N2)流量為25 L·min-1，輔助氣(N2)流量為5 Arbs，離子傳輸毛細管溫度設置為250℃，噴霧器溫度450℃。為提高定量靈敏度，選擇母離子和特征子離子為定量離子對，結合選擇反應監測(selective reaction monioring, SRM)模式掃描分析。碰撞能量見表1，采集時間均為0.2 s，碰撞氣體采用高純氬氣，碰撞氣壓力1.5 mTorr。Q1和Q3分辨率均設定為半峰寬0.7 Da。

表1 HPLC-APCI-QqQ-MS SRM模式下色素標準品的特征離子碎片和碰撞能量Table 1 Characteristic ion fragments and collision energy of the pigments by standard HPLC-APCI-QqQ-MS in SRM mode

2 結果與分析

2.1 色素定量方法的建立

采用液相色譜-三重四級桿質譜的SRM模式對不同部位、生態型和地點的銅藻中α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、ε-胡蘿卜素、ζ-胡蘿卜素、葉黃素、巖藻黃素、玉米黃質、角黃素、葉綠素a和葉綠素b共11種色素進行分析，并根據色素結構及離子化效率在正離子模式下獲得較強的信號峰，其中葉綠素a、葉綠素b、巖藻黃質和角黃素的[M+H]+離子分別為m/z 893.6、907.6、659.3和565.3，而α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、ε-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、 ζ-胡蘿卜素、玉米黃質和葉黃素產生[M]+離子分別為m/z 536.4、536.3、536.3、536.38、540.4、564.8和568.4。在二級質譜分析中依據色素的質譜裂解途徑，選取特征碎片離子作為定量離子，建立起SRM條件下的離子通道。11種色素標準溶液在APCI源的SRM模式下的總離子流圖見圖1。

注：a：α-胡蘿卜素；b：β-胡蘿卜素；c：ε-胡蘿卜素；d：γ-胡蘿卜素；e： ζ-胡蘿卜素；f：葉黃素；g：角黃素；h：玉米黃質；i：巖藻黃素；j：葉 綠素a；k：葉綠素b。Note: a: α-carotene. b: β-carotene. c: ε-carotene. d: γ-carotene. e: ζ-carotene. f: Lutein. g: Canthaxanthin. h: Zeaxanthin. i: Fucoxanthin. j: Chlorophyll a. k: Chlorophyll b.圖1 色素標準品在SRM模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of the pigments standard in SRM mode

為明確方法的精密度，按照低、中、高三種濃度點，分別取1、5、10 μg·mL-1的混合標準溶液進行測定，計算方法的精密度。在一天內連續進樣測定5次，記錄11種色素的峰面積及保留時間，分別計算各色素的保留時間和峰面積的精密度。結果表明，保留時間的日內精密度為0.08%～1.85%，峰面積的日內精密度為0.04%～1.13%；連續5天每天連續進樣測定5次，計算各色素的保留時間和峰面積的日間精密度，分別為0.07%～1.07%和0.15%～0.34%之間。精密度試驗結果表明本方法的精密度良好。

為了評估方法的準確性進行加標回收率試驗測定。將銅藻平均分成兩等份，一份不添加標準品作為對照(樣品A)，一份添加100 ng·mL-1色素標準品溶液(標樣B)作為加標樣品(樣品C)，分別采用上述提取方法進行提取，平行測定3次。按照公式：回收率=[m(樣品C)-m(樣品A)]/m(標樣B)×100%計算可知，11種色素的加標回收率均在73%～104.61%之間，且RSD低于15%，說明該方法滿足了對樣品中色素含量的測定要求。基于此，后續利用標準曲線法對銅藻中的植物色素進行含量測定。

表2 不同地區漂浮型銅藻中的色素含量Table 2 The pigments contents of floating-type S. horneri from different localities /(μg·g-1)

注：ND：未檢測出。同行不同小寫字母表示差異極顯著 (P<0.01)。

Note: ND: Not detected. Different lowercase letters in the same line indicate extremely significant difference at 0.01 level.

2.2 不同地區漂浮型銅藻中植物色素分析

比較分析威海、青島、日照、南通、東極島漂浮型銅藻中的色素分布，共檢測到10種植物色素，包括α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、ζ-胡蘿卜素、葉黃素、巖藻黃素、玉米黃質、角黃素、葉綠素a和葉綠素b。由表2可知，巖藻黃素和葉綠素a為漂浮型銅藻中的主要色素。東極島漂浮型銅藻中葉綠素a含量最高，極顯著高于與其他地區(P<0.01)，達到日照的22.6倍。葉綠素b含量遠低于葉綠素a，其中，威海和青島的漂浮型銅藻中葉綠素b含量均較低，但兩者差異不顯著；日照和南通中葉綠素b含量略微升高至0.8 μg·g-1，東極島中的葉綠素b含量急劇升高至3.6 μg·g-1，為威海中葉綠素a含量的6.0倍。

巖藻黃素在不同地區漂浮型銅藻中分布有所差異。從威海、青島、日照到南通，巖藻黃素的含量逐漸升高至282.4 μg·g-1，而東極島的巖藻黃素含量降為威海的0.87倍。從威海到東極島，玉米黃質和葉黃素含量整體呈下降趨勢，威海漂浮型銅藻中玉米黃質和葉黃素含量最高，分別為53.4、47.1 μg·g-1，東極島最低，分別約為威海中玉米黃質和葉黃素的0.12倍和0.15倍。威海、青島、日照和南通銅藻漂浮型的β-胡蘿卜素含量無顯著性差異，在0.1～0.4 μg·g-1之間，但東極島漂浮型銅藻的β-胡蘿卜素含量極顯著高于其他地區(P<0.01)，達到401.5 μg·g-1；僅在威海、青島和日照這3個地區的漂浮型銅藻中檢測到ξ-胡蘿卜素，其中青島漂浮型銅藻ξ-胡蘿卜素含量(7.8 μg·g-1)為其他兩個地區的3.7倍；α-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素和角黃素含量極低，僅在部分地區檢測到。總之，東極島漂浮型銅藻中葉綠素a、葉綠素b和β-胡蘿卜素含量高于其他地區，而最北的威海地區漂浮型銅中葉黃素、玉米黃質含量最高，東極島最低；南通漂浮型銅藻巖藻黃素含量最高，東極島最低。

2.3 不同生態型銅藻中植物色素分析

東極島的2種生態型銅藻(漂浮型和定生型)藻中共檢測到7種植物色素(圖2)，包括巖藻黃素、葉黃素、玉米黃質、葉綠素a、葉綠素b、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素。其中，巖藻黃素、β-胡蘿卜素(僅限漂浮型)和葉綠素a含量均大于222.4 μg·g-1，為銅藻的主要色素，而α-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質和葉綠素b的含量較少，在3.6～79.3 μg·g-1之內。此外，巖藻黃素、葉黃素、玉米黃質、葉綠素a和葉綠素b在定生型銅藻中的含量均高于漂浮型銅藻，具有極顯著差異(P<0.01)。α-胡蘿卜素僅在定生型銅藻中檢測到，β-胡蘿卜素僅在漂浮型銅藻中檢測到。從色素總量角度分析，定生型銅藻的色素總量是漂浮型銅藻的1.6倍。

注：**表示差異極顯著(P<0.01)。Note: **indicates extremely significant difference at 0.01 level.圖2 東極島不同生態型銅藻中植物色素的含量Fig.2 The contents of plant pigments from different types of S. horneri in Dongji is land

2.4 不同部位銅藻中植物色素分析

注：A：定生型銅藻；B：漂浮型銅藻。不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: A: Fixed S. horneri. B: Floating S. horneri. Different capital letters indicate significant difference at 0.05 level.圖3 東極島銅藻不同部位中植物色素的含量Fig.3 The contents of plant pigments in different parts of S. horneri in the Dongji Island

由圖3-A可知，定生型銅藻中共檢測到6種色素，分別為葉綠素a、葉綠素b、葉黃素、巖藻黃素、玉米黃質和α-胡蘿卜素，其中，葉綠素a含量在莖中最高，氣囊中最低，莖中葉綠素a含量分別為葉和氣囊的1.11倍和1.35倍；葉綠素b含量在葉中最高，分別為莖和氣囊的2.29倍和3.32倍，葉綠素b含量表現為氣囊<莖<葉，且三者間差異顯著(P<0.05)。巖藻黃素含量僅次于葉綠素a，其含量依次表現為莖<葉≈氣囊；葉黃素與玉米黃質含量變化趨勢一致，為葉>氣囊>莖；α-胡蘿卜素僅在莖和葉中檢測到，其中莖中 α-胡蘿卜素含量為葉的2.62倍。由圖3-B可知，漂浮型銅藻中共檢測到7種色素，包括葉黃素、巖藻黃素、葉綠素a、葉綠素b、玉米黃質、α-胡蘿卜素和β胡蘿卜素，其中，β-胡蘿卜素僅在漂浮型銅藻中檢出，主要分布在莖中，含量為338.50 μg·g-1；葉綠素a和巖藻黃素為漂浮型銅藻中的主要色素，其含量在莖、葉和氣囊中的分布與定生型銅藻類似，葉綠素a在莖中的含量分別為葉和氣囊的1.25倍和2.36倍；巖藻黃素在葉中的含量分別為莖和氣囊的1.15倍和1.27倍；葉綠素b在氣囊中的含量為莖和葉的1.75倍和2.10倍；葉黃素和玉米黃質含量均表現為氣囊>莖>葉；α-胡蘿卜素僅分布于莖和葉中，葉中的α-胡蘿卜素含量為莖的16.66倍(P<0.05)。

3 討論

液相色譜-質譜聯用儀中常用ESI和APCI離子源，其中APCI適用于弱極性物質，而本研究的銅藻色素，特別是類胡蘿卜素的極性較小，由此開發基于APCI離子源的HPLC-QqQ-MS色素定量分析方法，相比于常規的ESI離子源的HPLC-QqQ-MS色素定量方法，響應值高了一個數量級。此外，已報道的色素相關研究主要集中于葉綠素a、葉綠素b、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素、巖藻黃素，尚未建立常見色素的系統全面定量分析方法。銅藻中常用的色素檢測方法為分光光度法測定葉綠素a、類胡蘿卜素總量，HPLC法分析巖藻黃素和玉米黃質，但靈敏度均低于HPLC-QqQ-MS法。因此針對11種色素，采用APCI離子源并結合SRM模式，建立快速、靈敏的液相色譜-三重四級桿質譜定量分析方法。本研究結果表明，不同地區、生態型和部位銅藻中共檢測到10種色素，包括α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、ζ-胡蘿卜素、葉黃素、巖藻黃素、玉米黃質、角黃素、葉綠素a和葉綠素b。在當前儀器檢測靈敏度條件下，只有ε-胡蘿卜素未檢測出。經查閱文獻，在藍藻的類胡蘿卜素合成途徑中，γ-胡蘿卜素通常是作為β-胡蘿卜素的前體形式存在[29]，而大型藻類中β-胡蘿卜素的研究較多，針對ε-胡蘿卜素的報道較少，亦未有銅藻中檢測出該種色素的報道。

葉綠素a和葉綠素b是重要的光合色素，而β-胡蘿卜素具有多個共軛多烯雙鍵的特殊結構，它能與含氧自由基發生不可逆反應，達到清除自由基及淬滅單線態氧的作用[30]，因此對植物中的葉綠素具有一定的保護作用。本研究中，東極島漂浮型銅藻中的葉綠素a、葉綠素b和β-胡蘿卜素含量顯著高于其他地區。東極島位于舟山群島最東側，而舟山群島海域地處亞熱帶，氣候溫濕，受長江、錢塘江、甬江等沿岸流影響，東極島海域海水具有低鹽、水質肥沃等特點。加之受臺灣暖流影響，每年3-9月份東極島周圍海域受西南季風作用，水溫、鹽度、透明度明顯上升，給海洋藻類生長創造了有利條件[31]，這也表現為東極島漂浮型銅藻中參與光合作用的重要色素——葉綠素a、葉綠素b和β-胡蘿卜素含量高。此外，銅藻中玉米黃質和葉黃素含量變化一致，整體呈下降趨勢，這是因為葉黃素與玉米黃素互為同分異構體，兩者在結構上相似，僅有一個雙鍵位置不同，多將其作為一個整體進行報道[32]，一般認為兩者在自然界中共同存在，因此變化趨勢相同。

葉綠素是植物葉綠體內參與光合作用的重要色素，能夠捕獲光能并驅動電子轉移到反應中心[8]。巖藻黃素作為藻類植物的捕光色素，可以吸收能量并傳遞給葉綠素，并且可以轉移過量光能，使細胞免受傷害[33-35]，含量僅次于葉綠素a。本試驗結果表明，東極島中定生型與漂浮型銅藻中的色素結果顯示葉綠素a和巖藻黃素是主要的光合色素。分析色素總量發現，定生型銅藻的色素總量是漂浮型銅藻的1.6倍，這可能是因為定生型銅藻生長在潮下帶淺海巖礁上，陽光對其的輻射強度小，而漂浮型銅藻生長于海面之上，隨海浪漂浮，使得比表面積較大，陽光對其的輻射強度大。由此可知，定生型銅藻接受陽光的量要低于漂浮型銅藻，因此需要更大量的光合色素葉綠素和類胡蘿卜素，以增強收集和傳遞光能的作用，滿足藻體自身的光合效率。以往的研究在褐藻中未檢出α-胡蘿卜素[29]，而本研究改進了檢測方法，在東極島定生型和漂浮型銅藻中均檢出α-胡蘿卜素。此外，本研究發現定生型和漂浮型銅藻氣囊中均含有葉黃素、巖藻黃素、玉米黃質、葉綠素a和葉綠素b，其含量大小為葉綠素a>巖藻黃素>葉黃素≈玉米黃質>葉綠素b，說明通常認為的藻類氣囊僅起到使藻類植株漂浮于海面的作用不完全準確，氣囊中色素的存在說明它們也具有光合供養的作用，但相關作用機制仍需進一步深入研究。

4 結論

本試驗在前人研究基礎上，建立了11種銅藻色素的液質聯用方法，并首次對不同地區、生態型、部位的銅藻進行了色素種類與含量的分析，結果表明，不同地區、生態型、部位間銅藻中均存在色素種類與含量的差異，其中，定生型銅藻的色素總量是漂浮型銅藻的1.6倍，氣囊中含有大量的葉黃素、巖藻黃素、玉米黃質、葉綠素a和葉綠素b，說明在銅藻的生長過程中，氣囊扮演著十分重要的角色，這為了解銅藻漂浮生長機制奠定了一定的研究基礎，也為進一步從健康、可控的角度探究銅藻漂浮機制提供了數據支撐。