一株黃曲霉拮抗菌的篩選、鑒定及特性研究

李俊峰 滕麗麗 段效輝 李紅芳,* 胡琳慧 羅成坤

(1 青島科技大學海洋科學與生物工程學院/山東省生物化學工程重點實驗室，山東 青島 266042；2 煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000)

黃曲霉(Aspergillusflavus)是主要的食物腐敗真菌之一，可通過孢子傳播污染玉米、棉籽、花生等糧食作物和各種堅果[1-3]。黃曲霉所產的次生代謝產物黃曲霉毒素(aflatoxins)，具有極強的致癌、致突變和致畸作用，其對人類和家畜的健康威脅很大[4-6]。

目前，糧食和食品中黃曲霉防治和黃曲霉毒素污染去除的方法主要包括物理、生物和化學方法[7-8]。物理和化學方法可以解決部分污染問題，但多數物理和化學方法會造成產品營養價值的喪失、感官品質的下降，以及對人體健康的不良影響，且處理設備的成本較高、化合物的食物殘留、環境的二次污染等一系列問題[9-10]。相比物理、化學方法，生物方法處理食品和飼料中黃曲霉和黃曲霉毒素污染具有產品質量損失最小、使用安全、生態友好等優點[11-12]。研究表明，作為黃曲霉生物控制劑的微生物包括細菌、酵母和真菌，其中細菌菌株主要由芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、農桿菌屬和鏈霉菌屬等組成；真菌主要包括青霉屬、木霉屬、犁頭霉屬、根霉屬等[10,13-14]。在自然界中，黃曲霉與拮抗菌株的生長環境相同，可通過競爭生長空間和營養物質、分泌微生物活性物質等抑制黃曲霉孢子萌發和菌絲生長，或通過競爭黃曲霉毒素生產所需的營養素、分泌抗黃曲霉毒素代謝產物以降低黃曲霉毒素污染[15-16]，還能通過細胞的直接粘附作用或酶解等方式減少黃曲霉毒素[17-18]。故本研究從煙臺黃曲霉污染嚴重區域的土壤中篩選能明顯抑制黃曲霉生長的拮抗菌株，并選取抑菌活性較強菌株進行發酵培養，提取具有抑菌活性的粗產物，對其特性進行初步研究，探索其抑制黃曲霉生長的作用機理，初步考察拮抗菌株對黃曲霉毒素的生物降解，以期為谷物糧食和動物飼料中黃曲霉污染的生物防治及黃曲霉毒素的生物降解提供優良種質資源。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

采自煙臺花生種植區黃曲霉污染嚴重區域，共44份土壤樣品。黃曲霉產毒菌株CGMCC 3.2890 (AspergillusflavusCGMCC 3.2890，簡稱3.2890)來自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 培養基配置

PDB培養基：取200 g馬鈴薯，切成小塊并煮沸20 min，然后用紗布過濾并收集濾液，再加入20 g葡萄糖，補水至1 L，自然pH值。

PDA培養基：PDB培養基中加入2%的瓊脂。

淡薄培養基(g·L-1)：酵母膏 0.7、蛋白胨 1.0、葡萄糖 1.0、(NH4)SO40.2、MgSO4·7H2O 0.2、K2HPO41.0、瓊脂 20，加水至1 L，pH 值7.0～7.2。固體培養基則再加入2%的瓊脂即可。

香豆素降解培養基[19](g·L-1)：KH2PO40.25、NH4NO31.0、MgSO4·7H2O 0.25、FeSO40.001、香豆素1.0，調節pH 值為7.0。

LB、LA培養基，營養肉湯、營養瓊脂購自青島海博生物技術有限公司；細菌微量生化鑒定管購自北京路橋技術有限責任公司；細菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技公司；16S rDNA 的PCR 引物合成和PCR產物的序列測定均交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

除香豆素降解培養基需過濾滅菌外，其他培養基均121℃滅菌20 min，備用。

1.3 主要儀器與設備

HZQ-C空氣浴振蕩器，哈爾濱市聯電子技術開發有限公司；SPX型智能生化培養箱，寧波東南儀器有限公司；HH數顯恒溫水浴鍋，金壇市金城國勝實驗儀器廠；MyCyder PCR擴增儀，美國Bio-Rad公司；WFH-201B紫外透射反射儀，上海精科實業有限公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一儀器廠；牛津杯(內徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm)。

策略：判斷通電螺線管中的電流方向或N極、S極，應根據“安培定則”和“異名磁極相互吸引”的特點，用右手握住螺線管，使四指彎曲與電流方向一致，那么大拇指所指的那一端是通電螺線管的N極。

1.4 樣品中細菌的分離與純化

稱取5 g土樣于裝有45 mL無菌生理鹽水的250 mL三角瓶內(內含玻璃珠)， 160 r·min-1充分震蕩，然后用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋，并選擇適宜的稀釋度，吸取100 μL稀釋液涂布于LA平板，37℃倒置恒溫培養24～48 h。選取單菌落，采用三區劃線法進行純化，待菌落長出后，挑取單菌落轉接斜面，命名并保種。

1.5 黃曲霉孢子懸液的制備

將菌株CGMCC 3.2890接種到PDA斜面上，28℃恒溫培養72～96 h。待孢子充分形成后加入無菌生理鹽水，充分震蕩后制成孢子懸浮液，然后用血球計數板計數，并將孢子濃度調至106個·mL-1，4℃保存備用。

1.6 黃曲霉拮抗菌株篩選

1.6.1 初篩 吸取100 μL上述孢子懸液于PDA平板上，涂布均勻。將所分離菌株點種到平板上，每個平板點種數量適宜，并做重復，然后置于37℃恒溫培養24 h，觀察試驗菌株的抑菌活性，并采用十字測量法測定抑菌圈直徑。

1.6.2 復篩 將初篩的菌株接種于LB液體培養基中，37℃條件下160 r·min-1搖床培養24 h，然后10 000 r·min-1離心20 min，上清液經過濾除菌后備用。取100 μL孢子懸液(106個·mL-1)均勻涂布于PDA平板上，每板放置3個牛津杯，分別加入100、200 μL濾液，100 μL無菌水作空白對照，每組設2個平行，37℃恒溫培養24 h，觀察抑菌活性并用十字測量法測定抑菌圈直徑。

1.7 黃曲霉拮抗菌株的鑒定

1.7.1 拮抗菌株的形態學特征 黃曲霉拮抗菌株接種于LA平板，然后置于37℃恒溫培養24 h，觀察菌落形態特征并挑取少量菌體進行革蘭氏染色，觀察菌體形態。

1.7.2 拮抗菌株的生理生化特性 進行吲哚試驗、M-R反應、Ⅴ-P反應、苯丙氨酸脫氨試驗、硝酸鹽還原試驗，馬尿酸鹽水解、糖醇類發酵試驗，溶菌酶抗性、酪素水解、卵磷脂酶的測定、抗疊氮化鈉、淀粉水解、檸檬酸鹽的利用，耐鹽性試驗、產孢子培養等一系列試驗[20-21]。

1.7.3 拮抗菌株的16S rDNA序列鑒定 參照文獻[22]。拮抗菌株基因組DNA提取采用試劑盒的方法，分別以P1：5′-G C T G G A T C A C C T C C T T TC-3′ 和P2：5′-A G T G C C A A G G C A T C C A CC-3′為上、下游引物擴增拮抗菌株的16S rDNA。PCR反應體系：10× Buffer 5 μL、dNTP 1 μL、引物P1和P2各1 μL、DNA模板 2 μL、Taq酶1.5 μL，無菌重蒸水補充至50 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30個循環；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用膠回收試劑盒回收PCR擴增產物，由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將所得序列在GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中進行同源序列的比較，以Clustal W對拮抗菌株和相關模式菌株的16S rDNA進行多序列匹配排列比對后，用Mega 5.22軟件的Neighbor-Joining方法構建系統發育樹。

1.8 拮抗菌株的抑菌特性

1.8.1 抑菌物質的硫酸銨分級沉淀 按照1.6的方法制備拮抗菌株的無菌濾液，向濾液中加入硫酸銨至50%的飽和度，4℃條件下靜置過夜，然后10 000 r·min-1離心20 min，收集沉淀。上清液依次以同樣方法收集硫酸銨飽和梯度依次為60%、70%、80%的沉淀，將所得沉淀溶于10 mL dH2O，并經透析除鹽、聚乙二醇濃縮后過0.45 μm濾膜除菌。無菌生理鹽水為對照，采用瓊脂擴散法檢測其抑菌活性。

1.8.2 抑菌物質的溫度穩定性試驗 選用獲得沉淀最多且抑菌效果最佳的硫酸銨飽和度下提取的該粗提液進行溫度敏感性試驗。取適量粗提液分別于40、50、60、70、80、90℃水浴處理20 min，冷卻至室溫，備用。以無菌生理鹽水為對照，采用瓊脂擴散法檢測抑菌活性。

1.8.3 抑菌物質對黃曲霉孢子萌發的影響 在96孔板上每列第一孔加入80 μL抗菌液，依次倍半稀釋，每孔加入10 μL PDB培養液和10 μL含有104個黃曲霉孢子的懸浮液。抗菌液的稀釋倍數分別為0、2、4、8、16、32、64。空白對照為80 μL無菌生理鹽水加10 μL PDB培養液和10 μL黃曲霉孢子懸液。28℃恒溫培養24 h，按照公式(1)計算孢子萌發率并鏡檢觀察已萌發孢子的形態。

(1)。

1.9 拮抗菌株對黃曲霉毒素的降解

接種黃曲霉拮抗菌株至LB培養基中，37℃條件下160 r·min-1發酵24 h，然后加入黃曲霉毒素B1標準品至終濃度10 μg·mL-1，以無菌生理鹽水中加入黃曲霉毒素B1作空白對照，至于37℃恒溫培養，分別于培養第2、第4、第6天 取樣分析。發酵液采用Beacon黃曲霉毒素固相萃取柱進行純化，并用LC-MS檢測發酵液中黃曲霉毒素B1含量，每次試驗重復2次。

液相色譜條件：Diamonsil C18柱，規格為150 mm×4.6 mm×5 μm；柱溫30℃；流動相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈；梯度洗脫，流速0.4 mL·min-1；進樣量10 μL。

質譜條件：電噴霧正離子模式；多重反應監測；氣體溫度350℃、氣體流速10 L·min-1；Nebulizer為40 psi。

按照公式計算黃曲霉毒素的降解率：

降解率=

(2)。

2 結果與分析

2.1 黃曲霉拮抗菌株的初篩

采用梯度稀釋和平板涂布方法，從44份土樣中分離得到109株菌，分別命名為Y-1-1、Y-1-2、Y-2-1、Y-2-2……，以此類推。用平板點種法篩選到49株對黃曲霉CGMCC 3.2890拮抗作用較強的菌株，拮抗菌株菌落周圍黃曲霉的生長受到抑制而出現明顯的抑菌圈(圖1)。

圖1 部分菌株對黃曲霉CGMCC 3.2890 的拮抗作用Fig.1 Antagonistic activity of some strains against A. flavus CGMCC 3.2890

2.2 黃曲霉拮抗菌株的復篩

用牛津杯法檢測初篩菌株發酵上清液對黃曲霉的拮抗作用，根據抑菌圈大小從49株菌中篩得17株拮抗作用明顯的菌株。其中，菌株Y-17-3對黃曲霉CGMCC 3.2890拮抗作用最明顯 (圖2)，故選取該菌株做進一步試驗。

圖2 菌株Y-17-3上清液對黃曲霉CGMCC 3.2890的拮抗作用Fig.2 Antagonistic activity of supernatant from Y-17-3 against A. flavus CGMCC 3.2890

2.3 黃曲霉拮抗菌株Y-17-3的鑒定

2.3.1 菌株Y-17-3的形態學特征 由圖3可知，菌株Y-17-3在LA平板上培養24 h的菌落呈圓形或近圓形，直徑3～4 mm，表面凸起，有褶皺、邊緣不整齊，顏色為灰白色；表面無光澤、不透明。該菌體細胞呈桿狀，革蘭氏陽性，大小均勻，芽孢側生，橢圓，不膨大。

2.3.2 菌株Y-17-3的生理生化鑒定特征 根據《常見細菌鑒定手冊》[20]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[21]對菌株Y-17-3進行生理生化鑒定(表1)。將Y-17-3的生理生化特性與鑒定手冊中相應屬、種有關內容對照，初步鑒定該菌株為芽孢桿菌屬。

表1 菌株Y-17-3生理生化試驗結果Table 1 The physiological and biochemistry characteristics of the strain Y-17-3

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。

Note: ‘+’means positive. ‘-’ means negative

圖3 拮抗菌Y-17-3的菌落(A)及菌體 (B)形態Fig.3 Colony (A) and cell (B) morphology of the strain Y-17-3

2.3.3 菌株Y-17-3的16S rDNA序列分析及系統發育樹 采用細菌16S rDNA通用引物，以菌株Y-17-3的基因組DNA為模板，PCR擴增得到該菌株16S rDNA。測序結果顯示，該菌株16S rDNA的序列長度為1 455 bp。所得序列經MEGA程序細化處理后，在NCBI上進行BLAST分析，菌株Y-17-3與菌株Bacilluslicheniformis、Bacillusaerius關系比較緊密，同源性均為99%。采用Clustal W 進行多重序列對比，軟件MEGA 5.0(采用neighbor-joining方法，bootstrap 1 000次)構建系統發育樹，發現菌株Y-17-3與Bacillusaerius、Bacilluslicheniformis處于同一分支，但距離Bacillusaerius更近，驗證可信度為100(圖4)。結合菌株Y-17-3的菌落和菌體形態學特征、生理生化鑒定結果及16S rDNA序列分析，初步確定菌株Y-17-3為空氣芽孢桿菌(Bacillusaerius)。

圖4 基于16S rDNA序列同源性Y-17-3菌株的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the strain Y-17-3 based on the 16S rDNA sequence

2.4 菌株Y-17-3抑菌特性的初步研究

2.4.1 不同硫酸銨飽和度沉淀的抑菌效果 采用瓊脂擴散法檢測Y-17-3蛋白粗提液對黃曲霉的抑制作用。由圖5可知，與對照相比，不同硫酸銨飽和度的蛋白粗提液對黃曲霉的抑制有一定差異，50%、60%、70%硫酸銨飽和度下蛋白粗提液的抑菌圈直徑分別為8、10、15 mm，且70%飽和度的抑菌最強，80%飽和度蛋白粗提液無抑菌活性，故選用70%飽和度蛋白粗提液作進一步深入研究。

2.4.2 蛋白粗提液對溫度的敏感性 由圖6可知，除40℃處理組的黃曲霉抑菌圈比較明顯外(直徑10 mm)，其他處理組均未顯示抑菌活性，說明蛋白粗提液對溫度比較敏感。經酸(pH值<6)、堿(pH值>8)和胰蛋白酶水解處理后，喪失了對黃曲霉的抑制能力，說明該活性物質屬于蛋白類性質。

2.4.3 蛋白粗提液對黃曲霉菌孢子萌發的影響 黃曲霉菌孢子是黃曲霉散播和繁殖的主要形式之一，同時也是感染植物及食品的主要來源，而孢子萌發是黃曲霉有性生殖的開始，抑制孢子的萌發可以達到防治黃曲霉毒害的目的[23]。菌株Y-17-3蛋白粗提液對黃曲霉菌孢子萌發率及菌絲生長的影響結果見圖7，對照組的孢子可正常萌發，萌發率為40%±1.2%，孢子萌發時菌絲基本不彎曲，末端孢子形狀為規則的球形或橢球形，形態正常(圖7-B、圖8-A)。隨著菌株Y-17-3蛋白粗提液濃度的增加，孢子萌發率降低，蛋白粗提液原液處理組的孢子萌發率僅為12.1%±0.9%，即便萌發，菌絲長得也很短(圖7-A)，經過一段時間培養，長出的菌絲發生嚴重曲折、多分枝甚至畸形，孢子開始破裂(圖8-C)；蛋白粗提液原液8倍稀釋液處理組的孢子萌發率為 29.4%±1.1%，生長的菌絲彎曲，分支比粗液提原液處理組的幅度小，末端孢子畸形，輕度破損(圖8-B)；蛋白粗提液原液16倍稀釋液處理組的孢子萌發率為33.3%±0.7%。

2.4.4 蛋白粗提液對黃曲霉菌絲生長的影響 由圖9可知，試驗組(25%拮抗菌株Y-17-3蛋白粗提液)的黃曲霉菌絲質量顯著低于對照組，對照組黃曲霉菌大量生長，菌絲抱團生長，形成較大的菌絲球；試驗組加入菌株Y-17-3蛋白粗提液后黃曲霉的生長受到抑制，發酵液中未出現黃曲霉菌絲聚集的小白球，菌絲抱團生長能力減弱，表明菌株Y-17-3蛋白粗提物能夠通過抑制孢子萌發和菌絲生長影響黃曲霉的正常生長和產毒。

注：A：對照組；B：粗提液原液8倍稀釋；C：粗提液原液。Note: A: Control. B: 8 times dilution of crude protein extract. C: Crude protein extract.圖8 不同濃度的蛋白粗提液對黃曲霉CGMCC 3.2890菌絲形態的影響Fig.8 Effect of different concentration of Y-17-3 crude protein extract on the mycelium morphology of A. flavus CGMCC 3.2890

圖5 不同硫酸銨飽和度沉淀對黃曲霉CGMCC 3.2890的抑制結果Fig.5 Inhibition of crude protein precipitation with ammonium sulfate saturation on A. flavus CGMCC 3.2890

注：A：粗提液原液組；B：對照組。Note: A: Crude protein extract. B: Control group.圖7 Y-17-3蛋白粗提液原液對黃曲霉CGMCC 3.2890孢子萌發率的影響Fig.7 Effect of Y-17-3 crude protein extract on spore germination rate of A. flavus CGMCC 3.2890

注：A：黃曲霉+PDB培養液；B：25%蛋白粗提液+黃曲霉+PDB培養液。Note: A: Aspergillus flavus + PDB media. B: 25% crude protein extract + Aspergillus flavus + PDB media.圖9 Y-17-3蛋白粗提液對黃曲霉CGMCC 3.2890菌絲生長的影響Fig.9 Effect of Y-17-3 crude protein extract on the mycelial growth of A. flavus CGMCC 3.2890

2.5 菌株Y-17-3對黃曲霉毒素的降解

黃曲霉毒素是一類化學結構類似的化合物，均為二氫呋喃香豆素的衍生物，能以香豆素為唯一碳源生長的微生物，可作為黃曲霉毒素降解的候選菌株[19]。通過考察復篩所得17株拮抗菌株在香豆素降解培養基中的生長情況，發現菌株Y-17-3生長最好，菌液渾濁，發酵液中香豆素的殘留量為2.09 μg·mL-1，故選擇菌株Y-17-3進行黃曲霉毒素降解試驗。由圖10可知，隨著培養時間的增加，黃曲霉毒素的降解率逐漸升高，培養6 d時黃曲霉毒素的降解率可達90%，表現出優良的降解性能。

圖10 菌株Y-17-3對黃曲霉毒素B1的降解Fig.10 Degradation of aflatoxin B1 by strain Y-17-3

3 討論

黃曲霉所產的曲霉毒素是一種毒性很強的生物毒素，有極強的致癌作用。生物防治是目前處理黃曲霉毒素的最有效手段之一，也是近年來真菌毒素防治的研究熱點[8,11]。國外早有報道利用生物防治技術控制黃曲霉毒素污染的研究并取得良好效果[12, 16]，國內有關黃曲霉毒素生物控制技術的研究也已起步。本研究從煙臺不同區域黃曲霉污染土壤中分離、篩選出一株高效抑制黃曲霉生長及黃曲霉毒素合成的生防菌株 Y-17-3，經生理特性及分子生物學方法確定該菌株屬空氣芽孢桿菌(Bacillusaerius)。在微生物中，已有不少種屬具有黃曲霉及黃曲霉毒素污染的生防作用[10,13-14]，空氣芽孢桿菌作為纖溶酶[24]和脂肪酶[25]產生菌已有報道，但作為黃曲霉拮抗菌尚鮮見報道。

許多芽孢桿菌可通過分泌蛋白質類抗菌物質抑制黃曲霉生長和黃曲霉素的合成，本研究中，菌株 Y-17-3 抑制黃曲霉生長的化合物屬于蛋白類物質，70%硫酸銨飽和度所得沉淀對黃曲霉的拮抗作用最強，但該物質熱穩定性較差，50℃孵育10 min就失去對黃曲霉的抑制作用，與姚彥坡等[23]的研究結果類似。在枯草芽孢桿菌AU195發酵液的硫酸銨分級沉淀中，20%硫酸銨飽和度所得沉淀活性最強，40%和60%硫酸銨飽和度所得沉淀的抑菌活性相對較弱，而80%硫酸銨飽和度所得沉淀和上清液無抑菌活性[26]。本研究發現，隨著Y-17-3抗菌物質濃度的增加，對黃曲霉生長的抑制程度增強，與解淀粉芽孢桿菌F1的抑菌效果一致[3]。Osouli等[27]研究了枯草芽孢桿菌M419無細胞上清液對黃曲霉的抑制作用，該菌株分泌的脂肽類次級代謝產物對黃曲霉的抑制率為57%。Kong等[28]從東海分離一株海洋巨大芽孢桿菌，該菌株的去細胞上清液可抑制30.6%的黃曲霉生長。Afsharmanesh等[29]發現枯草芽孢桿菌UTB1可抑制黃曲霉孢子的萌發，抑制率為39.45%。而本試驗中菌株Y-17-3抗菌物質的抑菌形式具有多樣性，既能夠通過抑制黃曲霉孢子的萌發，又能通過降低菌絲抱團生長能力達到抑制黃曲霉的生長，對孢子萌發抑制率達到70.2%。

研究表明，能夠抑制黃曲霉孢子萌發和菌絲生長的菌株同時具有黃曲霉毒素降解能力[18,23]。以黃曲霉毒素的結構類似物香豆素為唯一碳源，李超波等[30]從金毛羚牛糞便中篩選到施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)F4菌株，AFB1去除能力達到90.03%。關心等[31]篩選到F6菌株，鑒定為蔬菜芽胞桿菌(Bacillusoleronius)，對AFB1的降解率為83%。Xia等[32]分離到一株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)JSW-1，對黃曲霉的抑制率為58.3%，30℃條件下發酵72 h對黃曲霉毒素的降解率為67.2%。Farzaneh等[18]從伊朗開心果中分離到一株黃曲霉R5的拮抗菌枯草芽孢桿菌UTB1，能夠將開心果中的黃曲霉毒素B1減少95%。本研究以香豆素為唯一碳源培養時，發現菌株 Y-17-3 的降解效果最好，說明該菌株有較強的黃曲霉素降解能力，培養6 d后黃曲霉毒素降解率達到90%，表明空氣芽孢桿菌Y-17-3可作為生物防治黃曲霉及黃曲霉毒素污染的候選菌株。

4 結論

本研究采用稀釋涂布法篩選到一株能強烈抑制黃曲霉生長且具有良好黃曲霉毒素降解能力的菌株 Y-17-3，經鑒定為空氣芽孢桿菌(Bacillusaerius)，為黃曲霉拮抗菌提供新的種質資源，說明可從自然界繼續挖掘新的生防菌株。該菌株的70%飽和硫酸銨的蛋白粗提物活性最強，可顯著抑制黃曲霉孢子萌發和菌絲抱團生長，但對溫度、pH值及蛋白酶敏感，因此在實際生產應用時應控制好外界條件。該菌株對AFB1的降解率可達90%，降解效果顯著，為黃曲霉的生物防治及在農業上的應用提供了理論依據和技術支撐，其抑菌機理和解毒機制有待進一步深入研究。