鹽脅迫下草麻黃電阻抗圖譜參數的變化及離子平衡機制

張 麗 牛雪飛 郭 棟 張艷陽 賈志國 劉俊喜 袁卉馥

(河北北方學院，河北 張家口 075000)

草麻黃(EphedrasinicaStapf)屬麻黃科麻黃屬草本植物，叢生小灌木，又名麻黃草、華麻黃。麻黃野生資源豐富，天然分布于我國北方各省沙丘沙地、丘陵溝壑、石質山坡等區域，具有抗寒、抗旱、抗風沙、耐鹽堿等特性[1]。麻黃作為我國傳統的中藥材，其藥用成分及藥理作用已經成為研究熱點[2-4]。隨著麻黃藥用價值的開發和利用，很多地區大力推廣麻黃人工栽培技術，推動了麻黃產業的發展。研究發現麻黃野生資源抗逆境能力強，但前人關于麻黃的研究多集中在其藥用價值方面[5-8]，而對其抗性機理研究較少。鹽堿地是我國廣泛分布的一種土壤類型，東北西部、華北、西北內陸地區和濱海地區都有分布[9]。因此，開展耐鹽機理的研究對促進麻黃產業栽培發展具有重要意義。

電阻抗圖譜(electrical impedance spectroscopy，EIS)技術已經廣泛應用于植物生理學研究領域[10]。目前，電阻抗圖譜在植物抗寒[11-14]、抗旱[15-16]、抗熱[17]、抗澇[18]、抗鹽堿[19-22]等研究領域均有報道，且已經證實EIS技術是一種有效研究植物抗逆性的物理手段。因此，本試驗以草麻黃為材料，將EIS技術應用于草麻黃抗鹽逆境研究中，并結合地上部相對電導率的變化，分析主要離子含量與電阻抗圖譜相關參數的關系，以期進一步揭示鹽脅迫下草麻黃植株細胞內部發生的變化，明確草麻黃的在鹽脅迫下的離子平衡機制及耐鹽能力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以2年生草麻黃盆栽苗為試驗材料，供試麻黃苗均采自內蒙古自治區麻黃種植基地，并經內蒙古自治區鄂爾多斯市鄂托克前旗慧源麻黃甘草研究所劉珊鑒定。

1.2 試驗設計

2016年3月，選取株型接近的麻黃苗栽種于底部帶托盤的塑料盆(上口徑18 cm、下口徑15 cm，高21 cm)中，每盆栽種3株，基質為草炭，于張家口市農業科學研究院科研溫室中進行正常栽培管理，60 d后，選擇生長健壯、長勢基本一致的植株進行NaCl脅迫處理。

選擇草麻黃生長季6月進行鹽脅迫處理，設置5個NaCl濃度梯度(50、100、200、300、400 mmol·L-1)，分別向每盆草麻黃苗澆相應濃度的鹽溶液500 mL，每7 d澆一次，以澆等量清水為對照。設置5個不同脅迫處理時間(7、14、21、28、35 d)，利用200 mmol·L-1NaCl溶液澆灌盆栽草麻黃苗，每7 d澆一次，每次澆500 mL。以不澆鹽溶液為對照，每7 d澆灌等量清水。每個處理5盆，設3次生物學重復，共15株。不同脅迫處理時間分別于脅迫后0、7、14、21、28、35 d采樣，不同濃度處理于脅迫后35 d采樣，分別測定各項指標。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 相對電導率的測定 將草麻黃地上莖均勻剪碎，稱量樣品0.5 g，加入20 mL去離子水，封口膜封口，于室溫下充分振蕩浸泡2 h，利用DDSJ-308電導率儀(上海儀電科學儀器有限公司)測定此時電導值(記作S1)，然后置于沸水浴15 min，隨后立刻冷水冷卻，再利用DDSJ-308電導率儀測定煮沸電導率(記作S2)，共測定3次，結果取平均值，按照公式計算相對電導率：

相對電導率=S1/S2×100%

(1)。

1.3.2 電阻抗圖譜參數的測定 剪取相同位置、粗度一致的草麻黃地上部草質莖進行電阻抗圖譜參數的測定。將各處理地上草質莖用去離子水沖洗干凈，濾紙吸干，切成1.5 cm莖段，并測量各莖段直徑(記作D，精確到0.01 mm)。利用HP4284A阻抗分析儀(美國Agilent公司)，采用電阻抗法[7]測定各項EIS 參數。首先將切好的草麻黃草質莖段置于2個玻璃管之間，通過玻璃管中的凝膠使待測樣品接觸兩側電極，分別對阻抗分析儀進行開路和短路校正，最后分別測定樣品在42個頻率(80 Hz～1 MHz)下的電阻值和電抗值，每處理測定8個莖段。初步可知草麻黃的電阻抗圖譜曲線表現為單一的弧，其等效電路可采用單-DCE模型[11]。

1.3.3 礦質離子含量的測定 用去離子水沖洗干凈各處理草麻黃植株，晾干，將地上部與地下部剪開，置于恒溫干燥箱，105℃殺青30 min，70℃烘干至恒重，然后用粉碎機粉粹樣品，過100目篩，收集各處理烘干樣品，利用HNO3-HF-HClO4消煮-ICP法處理，采用Thermo 630電感耦合等離子發射光譜儀(美國 Thermo 儀器公司)測定Na、K、Zn、Fe、Mg的含量[23]。

1.4 數據分析

利用Microsoft Excel 2010進行數據統計和繪圖；SPSS 16.0軟件進行數據方差分析及相關性分析；Pearson法評價電阻抗圖譜參數與離子含量、相對電導率的相關關系。圖、表中數據均為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對草麻黃地上部相對電導率的影響

由圖1可知，草麻黃地上部相對電導率隨著NaCl脅迫時間的延長和脅迫濃度的增加而逐漸上升。其中，200 mmol·L-1NaCl脅迫21 d的草麻黃地上部相對電導率無顯著變化，而脅迫28、35 d的草麻黃地上部相對電導率均顯著高于對照(0 d)，其中脅迫35 d的地上部相對電導率為對照的1.43倍(圖1-A)。100、200、300、400 mmol·L-1NaCl脅迫下的草麻黃地上部相對電導率均顯著高于對照(圖1-B)，其中200 mmol·L-1NaCl脅迫是相對電導率急劇增加的轉折點，200、300、400 mmol·L-1鹽脅迫下相對電導率分別為對照的1.43、1.52、1.65倍，且均達到顯著水平。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.圖1 NaCl脅迫下草麻黃地上部相對電導率的變化Fig.1 Changes of the relative conductivity in shoots of Ephedra sinica Stapf under NaCl stress

圖2 NaCl脅迫下草麻黃地上部高頻電阻率及低頻電阻率的變化Fig.2 Changes of specific resistance in high freguency and specific resistance in low freguency in shoots of Ephedra sinica Stapf under NaCl stress

2.2 NaCl脅迫對草麻黃地上部電阻抗圖譜參數的影響

2.2.1 NaCl脅迫對草麻黃地上部高、低頻電阻率的影響 由圖2可知，不同NaCl濃度、脅迫時間下，高頻電阻率(specific resistance in high frequency，r)和低頻電阻率(specific resistance in low frequency，r1)均顯著低于對照。隨著NaCl脅迫時間的延長，r呈先下降后升高再下降的趨勢(圖2-A)，r1表現為先下降后升高的趨勢(圖2-B)，r和r1均在脅迫21～28 d時出現回升，但隨后r急劇降低，脅迫35 d時僅為1.6×10-8Ωm。隨著脅迫濃度的增加，r和r1均呈先下降后升高再下降的趨勢(圖2-C、D)，且二者均在200 mmol·L-1NaCl脅迫下回升，分別為對照的31.9%、28.3%，但仍顯著低于對照，隨后二者均呈下降趨勢；400 mmol·L-1NaCl脅迫下，r下降到可忽略水平(7.29×10-9ΩM)，r1僅為對照的6.9%。結果表明，NaCl脅迫時間和脅迫濃度對r和r1的影響基本一致，但NaCl脅迫濃度的影響大于脅迫時間，說明脅迫時間的延長和脅迫濃度的增加均改變了草麻黃地上部細胞膜的透性及細胞內外的離子濃度。

2.2.2 NaCl脅迫對草麻黃地上部胞外、胞內電阻的影響 由圖3可知，NaCl脅迫下，胞外電阻率(specific extracellular resistance，re)與低頻電阻率(r1)變化規律基本一致，隨著脅迫時間的延長呈先下降后上升的趨勢(圖3-A)；隨著脅迫濃度的增加，re呈先下降后上升再下降的變化趨勢(圖3-C)，脅迫21 d時，re降至最低，為對照的14.1%；不同脅迫濃度下的re顯著低于對照，50 mmol·L-1NaCl脅迫下re降低為對照的17.6%，100、200 mmol·L-1NaCl脅迫下re呈上升趨勢，但仍顯著低于對照，400 mmol·L-1NaCl脅迫下re下降為對照的6.5%。

胞內電阻率(specific intracellular resistance，ri)隨著脅迫時間的延長和脅迫濃度的增加均呈先下降后升高再下降的變化規律(圖3-B、D)。NaCl脅迫35 d時ri下降至最低水平；不同濃度NaCl脅迫下，ri與r的變化規律基本一致，各脅迫處理均顯著低于對照，200 mmol·L-1NaCl脅迫下ri出現上升拐點，400 mmol·L-1NaCl脅迫下ri降至最低水平，說明此濃度脅迫已經超出了草麻黃對鹽脅迫的忍耐范圍。

圖3 NaCl脅迫下草麻黃地上部胞外電阻率及胞內電阻率的變化Fig.3 Changes of specific extracellular resistance and specific intracellular resistance in shoots of Ephedra sinica Stapf under NaCl stress

2.2.3 NaCl脅迫下草麻黃地上部弛豫時間及弛豫時間分布系數的變化 由圖4可知，不同NaCl脅迫時間下，弛豫時間(relaxation time, τ)無明顯的變化規律，弛豫時間分布系數(distribution coefficient of relaxation time, Ψ)均低于對照，整體呈先下降后升高再下降的趨勢，其中脅迫14和35 d的Ψ均與對照差異顯著。隨著NaCl脅迫濃度的增加，τ和Ψ均表現先下降后升高再下降的變化趨勢，50、400 mmol·L-1NaCl脅迫下的τ均顯著低于對照，100、200、300、400 mmol·L-1NaCl脅迫下的Ψ與對照均差異顯著。

圖4 NaCl脅迫下草麻黃地上部馳豫時間及馳豫時間分布系數的變化Fig.4 Changes of relaxation time and distribution coefficient of relaxation time in shoots of Ephedra sinica Stapf under NaCl stress

2.3 NaCl脅迫對草麻黃植株內的離子平衡的影響

2.3.1 NaCl脅迫下草麻黃地上部和根中Na+、K+含量的變化 由圖5可知，隨著脅迫時間的延長，草麻黃地上部和根中的Na+含量均呈逐漸增加的趨勢，而K+含量均呈逐漸下降的趨勢。不同脅迫時間下，地上部和根中Na+含量均顯著高于對照，脅迫35 d時，草麻黃地上部和根中Na+含量分別為對照的12.0和5.7倍；脅迫7、14 d時，草麻黃根中積累的Na+均顯著高于地上部(P<0.01)，隨著脅迫時間的延長，Na+向地上部運輸逐漸增多，脅迫21～35 d時，地上部積累的Na+含量均高于根系，其中脅迫35 d時差異顯著(P<0.01)。NaCl脅迫下，隨著脅迫時間的延長，草麻黃地上部和根中K+含量逐漸降低，各脅迫時間下根中K+含量均顯著低于對照，且地上部K+含量均高于根系。

注：不同小寫字母表示地上部的差異達到0.01顯著水平；不同大寫字母代表根系的差異達到0.01顯著水平。下同。Note: Diffferent lowercase letters indicate significant difference in shoot at 0.01 level. Different capital letters indicate significant difference in root at 0.01 level. The same as following.圖5 NaCl脅迫下草麻黃地上部和根中K+、Na+含量的變化Fig.5 Changes of K+ and Na+ contents in shoots and roots of Ephedra sinica Stapf under NaCl stress

2.3.2 NaCl脅迫下草麻黃地上部和根中K+/Na+的變化 由圖6可知，草麻黃地上部和根中K+/Na+隨著NaCl脅迫時間的延長而逐漸降低，且均顯著低于對照。不同脅迫時間下，草麻黃地上部K+/Na+為8.93～0.54，根中K+/Na+為3.07～0.35。脅迫7 d時，草麻黃地上部和根中K+/Na+分別降低為對照的34.8%和28.2%，由于脅迫初期草麻黃根中Na+含量增加較快，導致根中K+/Na+下降更明顯；脅迫35 d時，草麻黃地上部和根中K+/Na+分別僅為對照的6.1%和11.5%，說明隨著脅迫時間的進一步延長草麻黃地上部 K+/Na+下降得更為明顯。

2.3.3 NaCl脅迫對草麻黃中Zn、Fe、Mg含量的影響 由表1可知，NaCl脅迫下，草麻黃地上部和根中的Zn、Fe、Mg 含量的變化存在差異。隨著脅迫時間的延長，草麻黃地上部Zn含量表現為先下降后升高再下降的趨勢，根中Zn含量則呈波動式變化，無明顯規律。地上部Zn含量在脅迫14、21 d時顯著低于對照，但隨著脅迫時間持續延長，地上部Zn含量開始回升至對照水平，甚至高于對照；根中Zn含量在脅迫7 d顯著降至為對照的79.2%，脅迫21 d時僅為對照的72.4%，脅迫28 d時又迅速上升。隨著脅迫時間的延長，Fe含量呈波動式變化，無明顯規律，但通過比較草麻黃地上部和根中的Fe含量，發現二者存在互補關系，地上部Fe含量降低時，根中Fe含量增加，相反，根中Fe含量降低時，地上部Fe含量增加。Mg含量變化規律不明顯，在脅迫35 d時，地上部Mg含量顯著降低，但根中有所增加，且顯著高于對照。結果表明，NaCl脅迫影響了草麻黃植株對3種礦質元素的吸收和3種礦質元素在植株體內的分布。

表1 NaCl脅迫下草麻黃地上部和根中Zn、Fe、Mg含量的變化Table 1 Changes of Zn、Fe、Mg contnets in shoots and roots of Ephedra sinica Stapf under NaCl stress

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercase letters in the same colum indicate significant difference at 0.05 level.

圖6 NaCl脅迫下草麻黃地上部和根中K+/Na+的變化Fig.6 Changes of K+/Na+ratio in shoots and roots of Ephedra sinica Stapf under NaCl stress

2.3.4 NaCl脅迫對草麻黃地上部和根中5種陽離子總量的影響 由圖7可知，不同NaCl脅迫時間下，草黃麻地上部5種陽離子(Na+、K+、Zn2+、Fe3+、Mg2+)總量呈先上升后下降再上升的趨勢，根中則呈逐漸上升的趨勢。其中地上部5種陽離子總量在脅迫14 d時顯著高于對照，脅迫21 d時達到最高，為對照的1.60倍；根中5種陽離子總量在脅迫7 d時顯著高于對照，脅迫35 d時達到最高，為對照的1.79倍。不同NaCl脅迫時間下，草黃麻地上部5種陽離子總量均高于根系。5種陽離子總量的變化在一定程度上反映了細胞內部離子濃度的變化。

圖7 NaCl脅迫下草麻黃地上部和根中5種離子總量的變化Fig.7 Changes of NaCl stress on sum of five cations in shoots and roots of Ephedra sinica Stapf

2.4 NaCl脅迫下草麻黃地上部電阻抗圖譜參數、離子含量及相對電導率的相關性分析

由表2可知，Na+含量與ri、r呈顯著負相關，與相對電導率呈顯著正相關；K+/Na+與re、r、r1呈極顯著正相關，與ri呈顯著正相關；5種陽離子總量與re、r、r1呈顯著負相關；re與r1呈極顯著正相關，相關系數為1.000，ri和r呈極顯著正相關，相關系數為0.998；ri、r與Ψ呈極顯著正相關，γ與Ψ呈顯著正相關；相對電導率與re、ri、r、r1均呈負相關，與Ψ呈顯著負相關。結果表明，植物組織電阻抗圖譜參數的變化與細胞內外的離子濃度有關，細胞內外離子濃度除取決于細胞對離子的吸收外，還受細胞膜透性的影響。

3 討論

3.1 草麻黃電阻抗圖譜參數的變化與其抗鹽能力的關系

NaCl脅迫下，草麻黃地上部相對電導率增加，破壞了植物組織細胞的膜透性，細胞內外礦質離子的積累和平衡也會隨之改變，進而導致電阻抗圖譜參數發生改變。本研究結果表明，不同NaCl脅迫濃度和不同脅迫時間下，EIS參數的變化規律大致相同，隨著NaCl脅迫濃度的增加，草麻黃地上部的高頻電阻率(r)、低頻電阻率(r1)、胞內電阻率(ri)和胞外電阻率(re)等電阻抗參數均表現出先下降后升高再下降的變化趨勢。隨著200 mmol·L-1NaCl脅迫時間的延長，r和ri均呈先下降后升高再下降的變化趨勢，r1和re則表現出先下降后升高的變化規律。這與前人在流蘇[19]、平歐雜種榛[21]、毛竹抗鹽性[24]中的研究結果基本一致。NaCl脅迫下，re、ri、r、r1均低于對照，此結果與Na+積累相對應，200 mmol·L-1NaCl脅迫28 d時re、ri、r、r1出現了不同程度的回升，這可能與細胞膜透性的改變有關，但隨著脅迫時間的持續延長，鹽脅迫對細胞膜透性的傷害進入不可逆轉的階段，植株無法再依靠細胞膜自身修復能力來抵御逆境，因此EIS參數急劇降低到較低的水平。說明草麻黃對NaCl脅迫的忍耐極限濃度為200 mmol·L-1。r1和re在脅迫28 d后仍未進入持續降低階段，由此推測，草麻黃忍耐極限時間為28 d甚至更長，此結論還有待進一步驗證。

表2 草麻黃地上部電阻抗參數、相對電導率及離子含量之間的的相關性Table 2 Correlationship of shoots in Ephedra sinica Stapf between electrical impedance spectroscopy parameters, relative conductivity and mineral ions content

注：*表示相關性達到0.05顯著水平；**表示相關性達到0.01極顯著水平。

Note:*indicates significant correlation at 0.05 level.**indicates extemely significant correlation at 0.01 level.

3.2 NaCl脅迫下草麻黃地上部5種離子積累特征分析

鹽脅迫能夠改變細胞膜轉運蛋白的運輸能力，如誘導細胞膜和液泡膜上的Na+/H+逆向轉運蛋白的大量表達，進而影響植物組織內Na+、K+的積累[25]。本研究中，隨著鹽脅迫時間的延長，草麻黃地上部Na+含量增加顯著，脅迫14 d時草麻黃根系Na+含量高于地上部，脅迫21、28、35 d時地上部Na+含量均高于根系，表明鹽脅迫過程中Na+不斷運往地上部。這與閆道良等[26]和郭天文等[27]的研究結果相同。本研究發現隨著脅迫時間的延長，K+含量呈逐漸降低的趨勢，因此K+/Na+也隨著脅迫程度的加深而降低。這與前人在西瓜[28]、紅豆草[29]中的研究結果一致。

本研究表明，鹽脅迫影響了草麻黃地上部和根對Zn、Fe、Mg等微量元素的吸收和利用，且隨著NaCl脅迫程度的加深，草麻黃地上部和根系的Zn含量開始下降，隨后回升。這與前人在草莓[30]、平歐雜種榛[21]中的研究結果一致。說明NaCl在一定程度上可以增加對植株對Zn元素的吸收。NaCl脅迫影響了Fe、Mg在草麻黃地上部和根中的運輸和分配，其中Fe元素最為明顯。脅迫28 d后，草麻黃地上部Fe元素顯著降低，而根中則積累較多的Fe，表明鹽脅迫并未影響根系對基質中Fe的吸收，而是影響了Fe從根系向地上部的運輸；脅迫35 d 時，Mg在草麻黃根中也有一定積累，地上部則顯著低于對照，表明鹽脅迫在一定程度上抑制了Mg的向上運輸。與Mg相比，鹽脅迫對Fe向地上部運輸的抑制作用更為明顯，這可能是由于Fe屬于不可再利用元素，一旦固定不會發生二次分配的現象，而Mg可以在地上部不同組織之間發生轉移和再利用現象，在其他植物研究中也發現了類似的結果，如鹽脅迫下西瓜幼苗Mg元素顯著降低[28]。

EIS參數一方面隨著膜透性的改變發生變化，膜透性升高導致細胞內容物外滲程度增加；另一方面植物組織內可移動離子的積累也可以降低阻抗值。本研究中，草麻黃中EIS參數與5種陽離子總量之間呈負相關性，即5種陽離子總量越高，EIS參數(re、ri、r、r1)則越低。這與張麗等[21]在平歐雜種榛中的研究結果一致，但前人在月季抗寒研究中認為Ca2+、Mg2+含量與電阻抗圖譜參數呈正相關，提出Ca元素可能作為第二信使參與了植物在低溫脅迫下的化學反應[31]。關于礦質離子與電阻抗圖譜參數之間的相關關系還有待進一步研究。

4 結論

本研究結果表明，NaCl脅迫下EIS各項參數均表現出先下降后升高再下降或先下降后升高的變化規律，其中r、r1、ri和re可以有效反映草麻黃的耐鹽水平，草麻黃對NaCl的忍耐極限濃度為200 mmol·L-1；鹽脅迫影響了草麻黃地上部和根中的離子積累、運輸和分配，Na+含量增加，K+含量降低，同時抑制了Zn、Fe、Mg等微量元素向上運輸，導致根中礦質離子積累，而地上部減少；K+/Na+、5種陽離子(Na+、K+、Zn2+、Fe3+、Mg2+)總量與電阻抗圖譜參數之間存在顯著相關性。