干熱河谷地區芒果炭疽病菌生物學特性①

楊子祥 蘇銀玲 白明第 劉海剛 木萬福 段元杰 楊玉皎 方海東

(云南省農業科學院熱區生態農業研究所/元謀干熱河谷植物園 云南元謀 651300)

芒果是著名的熱帶水果之一，也是云南熱區的支柱產業之一[1]。云南芒果適栽區大都分布于金沙江、元江、怒江、南盤江等沿江的低海拔干熱河谷地區，氣候干熱、少雨，陽光充足，氣溫高，晝夜溫差大，小環境類型多，芒果品種多樣、品質優良，口味佳，深受人們喜愛[2]。但近年來，隨著芒果栽培面積的不斷擴大，其病害問題日益突出，嚴重影響了芒果的產量和品質。其中，由膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的芒果炭疽病已發展為區域種植中的重要病害之一[3-6]。芒果炭疽病具有潛伏侵染性，主要危害果實，是果實采收后危害最嚴重的病害之一，占果實病害總量的70%以上，常引起貯運期的果實腐爛，造成嚴重的經濟損失[7]。目前，國內外對芒果的研究多集中于芒果的栽培、新品種的選育、病害的識別和防治等方面，但對芒果炭疽病病原真菌的生物學特性研究甚少。因此，本研究采用菌絲生長速率法、血球計數板法，就不同環境條件對膠孢炭疽菌菌絲生長和孢子形成的影響開展研究，以期對芒果炭疽病的綜合防治提出相對合理、 科學的防控措施，為進一步推進云南芒果產業的持續、快速發展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)，采自云南干熱河谷地區芒果園炭疽病病葉，經分離獲純化后，于4℃冰箱中保存備用。培養基采用馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養基(PDA)，其中馬鈴薯200 g、葡萄糖17～20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 mL[8]。

1.2 方法[9-12]

1.2.1 溫度對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

挑取菌齡一致，直徑為7 mm的菌餅接種于PDA平板中央，分別置于5、10、15、20、25、30、35和40℃恒溫培養箱中倒置培養，每處理3次重復，6 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，10 d后每個培養皿加入10 mL無菌水洗下孢子，在顯微鏡下用血球計數板法測定各梯度產孢量。

1.2.2 光照對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

挑取菌齡一致，直徑為7 mm的菌餅接種于PDA平板中央，分別置于12 h光照/12 h黑暗、24 h全光照、24 h全黑暗的條件下，26℃恒溫培養箱中倒置培養，其余方法同1.2.1。

1.2.3 pH值對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

用1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L HCl調節滅菌后PDA培養基，制成pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的培養基。將菌齡一致，直徑為7 mm的菌餅接種于各pH值PDA平板中央，26℃恒溫培養箱中倒置培養，其余方法同1.2.1。

1.2.4 不同碳源對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

以查氏培養基為基礎培養，分別用等摩爾碳量的淀粉、甘油、蔗糖、麥芽糖、果糖和甘露醇替代蔗糖，以無碳源培養基為對照，將菌齡一致，直徑為7 mm的菌餅移入含有不同碳源培養基上，26℃恒溫培養箱中倒置培養，其余方法同1.2.1。

1.2.5 不同氮源對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

以查氏培養基為基礎培養，分別用等摩爾氮量的硝酸鉀、硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏和尿素替代硝酸鈉，以無氮源培養基為對照，將菌齡一致，直徑為7 mm的菌餅移入含有不同氮源培養基上，26℃恒溫培養箱中倒置培養，其余方法同1.2.1。

1.2.6 菌絲和分生孢子致死溫度測定

取10 mL菌絲體懸浮液或10 mL孢子懸浮液(400倍鏡下50～100個孢子/視野)于滅菌試管中，置于40、45、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59 和60℃的恒溫水浴鍋中，處理10 min后迅速冷卻。將菌絲體懸浮液或孢子懸浮液涂于PDA平板上培養，6 d后觀察菌絲、菌落生長狀況。

1.2.7 數據統計與分析

利用Excel 2007和DPS軟件進行數據統計，采用Duncan's法進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 溫度對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

由圖1可知，在10～25℃內菌絲生長速率隨著溫度升高而增大，25℃時菌落直徑達80.80 mm，在30℃時，菌絲生長速率下降，40℃時停止生長；病原菌產孢量在10～25℃時逐漸升高，25℃時的產孢量最大，為102.40×106個/mL。說明芒果炭疽菌菌絲生長和孢子形成的溫度均為10～35℃，適溫分別為15～25℃及20～25℃。相對而言，分生孢子形成的最適溫度略高于菌絲生長的最適溫度。

2.2 光照對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

圖1 不同溫度對病原菌菌絲生長及產孢的影響

芒果炭疽病菌在不同光照條件下均能生長，光照可促進芒果炭疽菌的菌絲生長，其中24 h全光照菌落直徑最大，達79.70 mm，12 h光照/12 h黑暗次之。光照對該菌孢子的形成有顯著促進作用，其中，以12 h光照/12 h黑暗促進作用最明顯，102.60×106個/mL(表1)。此外，光暗交替處理的菌落還會出現粉紅色與灰白色菌絲相間構成同心輪紋。

表1 不同光照對菌絲生長及產孢的影響

2.3 pH值對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

圖2表明，在不同pH值PDA培養基上芒果炭疽病菌菌絲能在較寬的pH值范圍內生長。在pH為4～8時，菌絲生長速率逐漸增快，pH為7時菌落最大，直徑達80.70 mm，之后隨著pH升高，菌絲生長速率下降，當pH為2時菌絲不能生長。芒果炭疽病病原菌在pH 3～10的范圍內均能形成分生孢子，分生孢子形成最佳pH值為4，此時孢子量高達860.00×106個孢子/mL，之后隨著pH升高，產孢量下降。上述結果表明，偏酸性至中性條件有利于芒果炭疽病菌菌絲生長，且在酸性條件下有利于分生孢子形成。

2.4 不同碳、氮源對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響

由表2可知，芒果炭疽病菌對麥芽糖的利用率最高，培養6 d后菌落直徑達80.00 mm；在無碳源的培養基上菌絲雖然生長較快，但菌絲稀疏，病原菌對其它碳源利用高低依次為淀粉＞蔗糖＞甘油＞甘露醇＞果糖。麥芽糖為碳源的培養基上，不僅菌絲生長迅速、孢子形成量也最高，為48.20×106個/mL，而甘露醇不利于該菌產孢，僅為5.40×106個/mL。

從表3可知，牛肉膏為芒果炭疽病菌適宜氮源，培養6 d后菌落直徑達83.50 mm，極顯著高于其它氮源處理的菌落大?。痪z在硫酸銨和尿素為氮源的培養基上生長速度緩慢，菌落直徑均為25.67 mm；說明病菌對氮源利用高低依次是牛肉膏＞蛋白胨＞酵母膏＞硝酸鈉＞硝酸鉀＞硫酸銨＝尿素。牛肉膏為碳源對孢子的形成較好，硝酸鉀、硫酸銨對孢子的形成相對較差，蛋白胨和尿素為氮源不產生孢子不利于產孢。

圖2 不同pH對病原菌菌絲生長及產孢的影響

表2 不同碳源對菌絲生長及分生孢子形成的影響

表3 不同氮源對菌絲生長和孢子形成的影響

2.5 菌絲和分生孢子致死溫度測定

試驗中通過設置不同溫度梯度，測定了芒果炭疽病菌絲和分生孢子的致死溫度。結果表明，芒果炭疽病菌絲致死溫度為56℃，10 min；分生孢子的致死溫度為51℃，10 min(表4)。

表4 菌絲和分生孢子的致死溫度

3 討論

云南干熱河谷地區芒果生產中炭疽病嚴重危害葉片和果實，特別是在芒果果實生長期間普遍存在著炭疽病菌的潛伏侵染，而且帶菌率高。本研究就不同溫度、光照、pH值、營養等環境因素對芒果炭疽病菌菌絲生長和孢子形成的影響進行了對比分析。初步研究表明，芒果炭疽病菌10～35℃范圍內均可生長，其菌絲生長和孢子形成的最適溫度為25℃，在20℃以下或30℃以上該菌菌絲生長速度和產孢量明顯減少，分生孢子形成的最適溫度略高于菌絲生長的最適溫度。這些特性與芒果炭疽病每年在田間的消長規律關系密切。云南干熱河谷地區芒果炭疽病在1年內有多個發病高峰，一般年份春、夏梢發病重，秋梢發病輕。但如果8月遇陰雨天氣，則可能發生第3次高峰期，秋梢也會嚴重感病。芒果炭疽病菌對酸堿度的適應能力強，pH為3～10的范圍內菌絲均能生長和產孢，病菌絲生長最佳pH為7，分生孢子形成最佳pH值為4，說明偏酸性至中性條件有利于病菌菌絲生長，在酸性條件下有利于分生孢子形成。這與黃思良等[13]對芒果炭疽病菌的生物學特性的研究結果基本一致，但略有差異，這可能與寄主及病原菌生長環境差異有關。24 h光照條件下有利于菌絲生長，而12 h光照/12 h黑暗可促進其產孢，與劉愛媛等[14]對荔枝膠孢炭疽菌的研究結果之間有一定差異，這可能與炭疽病菌在不同種類植物上寄生或變異有關，需要進一步研究證實。以麥芽糖為碳源和以牛肉膏為氮源時病原菌菌絲生長最快、產孢量最大，說明芒果炭疽病菌的生長需要碳氮源。芒果炭疽病菌菌絲對高溫的耐受能力比分生孢子強，病菌絲致死溫度為56℃，10 min；分生孢子的致死溫度為51℃，10 min。本研究結果可為在芒果果實上應用熱處理措施控制炭疽病選擇處理溫度和時間提供參考。關于不同的熱處理方法、溫度、時間對芒果果皮中炭疽病菌活力的抑制作用還需進一步研究[15]。因此，在芒果炭疽病蔓延時期，防治時要采取不同措施，錯開病原菌生長發育的最適環境條件防止芒果炭疽病的發生，如選擇高地建園，溝系暢通，科學施肥，合理修剪，改善果園土壤環境等。

近年來，由于芒果種植效益突出，管理較其他水果簡單，農民種植芒果的積極性比較高，種植區域不斷擴大，接踵而來的病害日益蔓延，越發嚴重。因此，本研究為芒果炭疽病菌分子生物學、病原學、病理學的新發現提供理論基礎，對今后該病的發生與防治有著深刻的指導和現實意義，為芒果炭疽病防治提供理論依據。隨著分子生物學的快速發展，本試驗運用傳統的實驗方法進行研究，可能存在很多方面的不足，所以，今后對該病原菌的生物學特性和致病機理等方面的問題，應采用分子生物學的方法作進一步的試驗研究，以便促進芒果產業綠色無公害的快速發展。