干擾素γ和TRAIL聯合對HaCaT細胞程序性壞死的影響及機制研究

壽艷紅 張臻 駱肖群 陳圣安 李峰 朱小華 林盡染 秦海紅 杜鵑 陳蓀奕 楊永生 徐金華

復旦大學附屬華山醫院皮膚科，上海 200040

程序性壞死是一種可調控的胱天蛋白酶（caspase）非依賴性細胞程序性死亡方式，細胞呈壞死樣結構特點［1］。以往研究證實，腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導的程序性壞死可發生在小鼠成纖維細胞L929、人組織淋巴瘤細胞U937 和Fas 相關死亡域蛋白缺陷型人白血病T 細胞系Jurkat 細胞中［2-4］，干擾素γ（IFN-γ）和TNF 相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）可分別誘導巨噬細胞和小鼠胚胎成纖維細胞程序性壞死［2，5］。較為公認的機制是受體相互作用蛋白1（receptor interaction protein kinase 1，RIP1）/RIP3/混合系激酶區域樣蛋白（mixed lineage kinase domainlike protein，MLKL）通路傳遞死亡信號，活性氧參與死亡執行［6-7］。關于角質形成細胞（keratinocyte，KC）的程序性壞死研究較少，主要集中于中毒性表皮壞死松解癥（TEN）和Stevens-Johnson 綜合征（SJS）的發病機制研究［8-9］。TEN/SJS 是以 KC 廣泛性壞死為特征的疾病，Saito等［9］用電鏡發現TEN患者中KC 發生的壞死是程序性壞死，小鼠實驗中通過抑制程序性壞死可以完全阻斷TEN 樣病變也證明了這一點。此外，以往研究證實，IFN-γ 在TEN患者皰液和外周血中濃度升高［7，10］。de Araujo等［11］還發現，皰液中TRAIL濃度有明顯升高。由此我們推測，IFN-γ 和 TRAIL 是 SJS/TEN 發病中重要的細胞因子，因此我們探索應用IFN-γ 和TRAIL 誘導KC 程序性壞死，探討程序性壞死在TEN/SJS 發病機制及治療中的作用。

材料與方法

一、細胞、試劑和儀器

HaCaT 細胞來自美國ATCC 細胞庫；高糖DMEM、胎牛血清、0.25%胰酶產自美國Gibco公司；細胞凋亡檢測試劑盒產自美國BD 公司；反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒產自日本TaKaRa公司；RIP3、MLKL 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；兔抗人RIP1、RIP3、MLKL和磷酸化 RIP1（pRIP1）、RIP3（pRIP3）、MLKL（pMLKL）抗體產自美國 CST 公司；IFN-γ、TRAIL 產自美國PeproTech 公司?；钚匝鯔z測試劑盒、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 555標記的山羊抗兔IgG產自上海碧云天生物技術公司。

二、細胞培養

將HaCaT細胞接種于含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞用于各項實驗。

三、噻唑藍（MTT）法檢測細胞增殖

取對數生長期HaCaT 細胞按1×104/孔接種于96孔板，在37 ℃及5%CO2環境中培養24 h，去上清液，分別加入12.5、25、50、100 μg/L IFN-γ或1、2、4、8 μg/L TRAIL，或同時加入不同濃度的 IFN-γ 和TRAIL，對照組不加IFN-γ和TRAIL，空白孔不加細胞，只加培養基，每種處理設5 個復孔，培養48 h后，每孔加入10 μl MTT溶液，在37 ℃、5%C02環境中孵育4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜溶液110 μl，置搖床上充分振蕩10 min，在酶標儀490 nm波長下測量各孔吸光度（A值）。細胞存活率=［各處理組平均A490 值-空白組平均A490 值）/（對照組平均A490 值-空白組平均A490 值）］×100%。預實驗發現，50、100 μg/L IFN-γ或4、8 μg/L TRAIL均可抑制細胞生長，但 50 μg/L IFN-γ 和 4 μg/L TRAIL 及更高濃度IFN-γ、TRAIL 同時作用可顯著抑制細胞存活，因此選擇 50 μg/L IFN-γ、4 μg/L TRAIL 進行后續實驗。此外，為了確定caspase 抑制劑zVAD（美國Pepro Tech 公司）作用時間及濃度，分別加入10、20、40、60、80 μmo/L zVAD 預處理0.5、1、1.5 h，再加入 50 μg/L IFN-γ 和 4 μg/L TRAIL 處理48 h 后檢測各孔A值，發現 ≥ 40 μmo/L zVAD 預處理 1、1.5 h 均可顯著抑制細胞存活，因此選擇40 μmo/L zVAD預處理1 h作為實驗條件。

四、實驗分組

取對數生長期HaCaT 細胞按1 × 106/孔接種于6 孔板，預培養24 h；去上清液，陰性對照組不加IFN-γ 或TRAIL，處理組分別加入50 μg/L IFN-γ（IFN-γ 組）、4 μg/L TRAIL（TRAIL 組）、50 μg/L IFN-γ +4 μg/L TRAIL（細胞因子聯合組）或40 μmol/L zVAD預處理1 h后同時加入50 μg/L IFN-γ及4 μg/L TRAIL（zVAD 聯合組），作用48 h，光鏡下觀察細胞形態后用于以下實驗。

五、流式細胞儀檢測細胞壞死

收集細胞，用含有乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶溶液消化，移至流式檢測管，PBS洗滌2次，1×結合緩沖液洗滌1次，重懸細胞，加入5 μl膜聯蛋白V混勻后，加入5 μl碘化丙錠，混勻，室溫下避光孵育15 min；每管加入400 μ1結合緩沖液，混勻，流式細胞儀檢測細胞壞死率。

六、qPCR檢測RIP3、MLKL mRNA相對表達量

收集細胞提取RNA，使用反轉錄試劑盒合成cDNA，進行定量PCR。應用Primer5.0設計引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。RIP3 正向引物 5′-TGTACAAGTCTAGAGCTAGCAT GTCGTGCGTCAAGTTA-3′，反向引物5′-CGCGGCC GCGGATCCTTATTTCCCGCTATGATT-3′；MLKL：正向引物5′-GGATTGCCCTGAGTTGTTGC-3′，反向引物 5′-AACCGCAGACAGTCTCTCCA-3′；GADPH 正向引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，反向引物 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR 反應體系20 μl，分別為綠色熒光染料 SYBR 10 μl，正反向引物各 0.04 μl，參比染料 ROX 0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 7.52 μl，反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環。反應結束后，確認各個基因的閾值循環數（Ct），利用GAPDH 校正?！鳌鰿t =（實驗組 Ct目的基因-Ct管家基因）-（陰性對照組Ct目的基因- Ct管家基因），計算RIP3、MLKL基因的相對表達水平（2-△△Ct）。

七、Western印跡檢測RIP1、pRIP1、RIP3、pRIP3、MLKL、pMLKL、caspase 8蛋白水平

收集陰性對照組、IFN-γ組、TRAIL組、細胞因子聯合組細胞，向HaCaT 細胞中加入裂解液，冰上裂解5 min 后，將細胞刮下做超聲處理，4 ℃12 000×g離心15 min，吸取上清液分裝并保存。用BCA法測定蛋白濃度，以20 μg 蛋白樣品上樣，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚偏氟乙烯（PVDF）轉膜，5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉1 h，加入兔抗人RIP1、pRIP1、RIP3、pRIP3、MLKL、pMLKL 蛋白抗體，4 ℃孵育過夜后，加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，ECL發光法檢測反應條帶。以GAPDH 為內參，用ImageJ 軟件分析條帶灰度。

另取zVAD 聯合組、陰性對照組、細胞因子聯合組細胞重復上述步驟，檢測各組上述各蛋白表達水平。

八、免疫熒光染色觀察pRIP3、pMLKL 在細胞中的表達分布

HaCaT細胞爬片，預培養24 h后，去上清液，分為陰性對照組、IFN-γ組、TRAIL組和細胞因子聯合組，處理同以上實驗分組，作用48 h 后，4%多聚甲醛固定15 min，0.2%Triton X-100破膜15 min，5%牛血清白蛋白封閉30 min，加兔抗人pRIP3（1∶500）、兔抗人 pMLKL（1∶500）一抗，4 ℃孵育過夜；加Alexa Fluor 488 標記的山羊抗兔 IgG（1∶200）、Alexa Fluor 555標記的山羊抗兔IgG（1∶200）避光室溫下孵育1 h，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-imidino-2-henylndoleDAPI）染核5 min，每步驟間均PBS漂洗3次，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

九、以2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）為熒光探針檢測HaCaT細胞內活性氧

用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L。將HaCaT細胞接種在24孔板中預培養24 h 后，去上清液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min。用無血清培養液洗滌細胞3 次，將細胞分為陰性對照組、IFN-γ 組、TRAIL組和細胞因子聯合組，處理方法同以上實驗分組，刺激1.5 h，收集細胞用流式細胞儀檢測活性氧水平。

十、統計分析

用SPSS 22 進行統計學分析。實驗重復3 次，數據均以±s表示，不同組間觀察指標的比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、不同處理對HaCaT細胞形態的影響

光鏡下觀察發現，陰性對照組HaCaT細胞形態無變化，細胞生長密集，呈上皮樣貼壁生長。不同細胞因子作用48 h 后，細胞形態均發生變化。IFN-γ組、TRAIL 組細胞數減少；細胞因子聯合組、zVAD聯合組細胞數減少，出現壞死樣形態特征，如細胞膜破裂、細胞器腫脹、核皺縮等。

二、不同處理對HaCaT細胞存活率的影響

作用48 h后，陰性對照組HaCaT細胞存活率為100%，但 IFN-γ 組、TRAIL 組、細胞因子聯合組、zVAD 聯合組分別為 73.16% ± 5.71%、81.46% ±4.68%、72.18%±2.93%、69.67%±3.24%，單因素方差分析顯示，差異有統計學意義，F= 24.34，P＜0.001。兩兩多重比較顯示，IFN-γ 組、細胞因子聯合組、zVAD 聯合組HaCaT 細胞存活率顯著低于陰性對照組，差異均有統計學意義（t值分別為26.83、27.82、30.32，均P＜ 0.05），細胞因子聯合組與zVAD聯合組間差異無統計學意義，t=2.51，P＞0.05。

三、不同處理對HaCaT細胞壞死的影響

IFN-γ組、TRAIL組、細胞因子聯合組、zVAD聯合組HaCaT 細胞壞死率分別為6.42% ± 1.36%、6.35% ± 1.91%、9.86% ± 1.31%、10.33% ± 2.16% ，陰性對照組為5.26%±0.91%，5組間差異有統計學意義，F=6.17，P＜ 0.01（圖1）。細胞因子聯合組、zVAD 聯合組均顯著高于陰性對照組，t值分別為4.61、5.07，均P＜ 0.05，細胞因子聯合組與zVAD 聯合組間差異無統計學意義（t=0.47，P＞ 0.05）。

四、不同處理對HaCaT 細胞RIP3、MLKL mRNA表達的影響

圖2 IFN-γ、TRAIL、zVAD 單獨或聯合作用 48 h 后 HaCaT 細胞RIP3、MLKL mRNA 表達情況 n=3。a：與陰性對照組比較，差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。IFN-γ：干擾素γ；TRAIL：腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體；zVAD：胱天蛋白酶抑制劑；RIP3：受體相互作用蛋白3；MLKL：混合系激酶區域樣蛋白

圖3 干擾素γ、TRAIL 單獨或聯合作用48 h 后HaCaT 細胞RIP1、pRIP1、RIP3、pRIP3、MLKL、pMLKL 蛋白表達情況 TRAIL：腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體；RIP：受體相互作用蛋白；MLKL：混合系激酶區域樣蛋白

作用 HaCaT 細胞 48 h 后，IFN-γ 組、TRAIL 組、細胞因子聯合組、zVAD 聯合組及陰性對照組間RIP3、MLKL mRNA水平差異均有統計學意義（F值分別為9.16、28.49，均P＜ 0.05，圖2）。兩兩多重比較顯示，細胞因子聯合組、zVAD 聯合組RIP3 mRNA 水平明顯高于陰性對照組（t值分別為0.99、1.84），MLKL mRNA亦高于陰性對照組（t值分別為1.51、2.17），均P＜ 0.05，細胞因子聯合組與zVAD聯合組間RIP3、MLKL mRNA水平差異無統計學意義（t值分別為0.84、0.65，均P＞ 0.05）。

五、不同處理對HaCaT細胞程序性壞死相關蛋白等表達的影響

作用 48 h 后，IFN-γ 組、TRAIL 組 RIP1、RIP3、MLKL 蛋白表達水平與陰性對照組相比無明顯變化，但細胞因子聯合組RIP1、RIP3、MLKL、pRIP1、pRIP3、pMLKL 蛋白表達水平高于陰性對照組（圖3，表1，均P＜ 0.05）。zVAD 聯合組與細胞因子聯合組相比，caspase 8 表達降低，RIP1、RIP3、MLKL、pRIP1、pRIP3、pMLKL 蛋白表達水平升高（圖4，表2，均P＜ 0.05）。

圖4 干擾素γ與TRAIL聯合及共同與zVAD聯合對HaCaT細胞pRIP1、RIP1、胱天蛋白酶8、pRIP3、RIP3、pMLKL、MLKL 蛋白表達的影響 TRAIL：TNF 相關凋亡誘導配體；zVAD：胱天蛋白酶抑制劑；RIP：受體相互作用蛋白；MLKL：混合系激酶區域樣蛋白

表1 干擾素γ、TRAIL單獨或聯合作用對HaCaT細胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白及其磷酸化蛋白表達的影響（±s）

表1 干擾素γ、TRAIL單獨或聯合作用對HaCaT細胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白及其磷酸化蛋白表達的影響（±s）

注：n=3。與陰性對照組（不用干擾素γ、TRAIL或zVAD處理）比較，a P ＜ 0.01，b P ＜ 0.05。TRAIL：TNF相關凋亡誘導配體；RIP：受體相互作用蛋白；MLKL：混合系激酶區域樣蛋白

組別陰性對照組干擾素γ組TRAIL組細胞因子聯合組F值P值pRIP1 1 1.387±0.040 1.878±0.033a 2.144±0.494a 8.819 0.006 RIP1 1 1.929±0.263 1.996±0.298 2.790±0.560a 21.158＜0.001 pRIP3 1 2.017±0.291b 1.659±0.032 4.344±0.802a 34.867＜0.001 RIP3 1.025±0.043 1.318±0.224 1.510±0.341b 4.272 0.045 pMLKL 1 2.032±0.075 3.683±0.974a 4.494±0.489a 9.432 0.005 MLKL 1 1.247±0.073 1.319±0.228 1.452±0.139a 5.605 0.023

六、pRIP3、pMLKL在細胞中的表達及分布

1.pRIP3 在細胞中的表達及分布：HaCaT 細胞經細胞因子聯合作用48 h 后細胞質可見強綠色點狀或團塊狀綠色熒光斑點，IFN-γ組、TRAIL組作用48 h后細胞質可見淺綠色熒光斑點，陰性對照組細胞未見明顯的綠色熒光斑點，見圖5。

2.pMLKL 在細胞中的表達及分布：經細胞因子聯合作用48 h后，HaCaT細胞膜可見明顯紅色熒光斑點，IFN-γ組、TRAIL組細胞膜僅見淺紅色熒光斑點，陰性對照組細胞未見明顯熒光斑點，見圖6。

七、不同處理對HaCaT細胞活性氧產生的影響

作用 48 h 后，IFN-γ 組、TRAIL 組、細胞因子聯合組活性氧平均熒光強度分別為494.33 ± 63.59、434.67 ± 16.57、901.33 ± 64.49，陰 性 對 照 組 為199.01±4.04，4組間差異有統計學意義，F=26.81，P＜0.001。細胞因子聯合組與陰性對照組比較，差異有統計學意義，t=702.00，P＜ 0.05。

討 論

本研究顯示，IFN-γ 和 TRAIL 共同作用可導致細胞存活率明顯下降、壞死率升高，說明IFN-γ 和TRAIL 可誘導細胞壞死。zVAD 為caspase 抑制劑，當其預處理HaCaT細胞 1 h 后 ，聯合 IFN-γ 和TRAIL（zVAD 聯合組）可致細胞存活率進一步下降、壞死率進一步升高，但細胞存活率、壞死率在細胞因子聯合組與zVAD 聯合組之間差異均無統計學意義，提示IFN-γ和TRAIL誘導的細胞死亡類型與zVAD 聯合組誘導的類似。光鏡下觀察發現，細胞因子聯合組和zVAD 聯合組均出現壞死樣形態特征。提示 IFN-γ 和 TRAIL 聯合對 HaCaT 細胞程序性壞死具有一定影響。

表2 干擾素γ與TRAIL聯合及共同與zVAD聯合對HaCaT細胞pRIP1、RIP1、caspase 8、pRIP3、RIP3、pMLKL、MLKL蛋白表達的影響（±s）

表2 干擾素γ與TRAIL聯合及共同與zVAD聯合對HaCaT細胞pRIP1、RIP1、caspase 8、pRIP3、RIP3、pMLKL、MLKL蛋白表達的影響（±s）

注：n=3。與細胞因子聯合組（干擾素γ+TRAIL）比較，a P ＜0.01，b P ＜0.05。TRAIL：TNF相關凋亡誘導配體；zVAD：胱天蛋白酶抑制劑；RIP：受體相互作用蛋白；MLKL：混合系激酶區域樣蛋白

組別陰性對照組細胞因子聯合組zVAD聯合組F值P值pRIP1 1a 1.723±0.048 1.874±0.121b 116.175＜0.001 RIP1 1 0.991±0.109 1.241±0.067a 10.998 0.010胱天蛋白酶8 1a 2.056±0.190 1.007±0.057a 84.271＜0.001 pRIP3 1b 2.792±0.456 7.226±1.175a 58.25＜0.001 RIP3 1 1.144±0.145 1.842±0.341a 13.305 0.006 pMLKL 1a 1.644±0.041 2.111±0.143a 127.111＜0.001 MLKL 1 0.970±0.135 1.335±0.098a 13.319 0.006

圖5 pRIP3 免疫熒光檢測（×400） 綠色熒光斑點表示pRIP3蛋白，陰性對照組未見明顯綠色熒光斑點，干擾素γ組、TRAIL組細胞質可見淺綠色熒光斑點，細胞因子聯合組細胞質可見強綠色熒光斑點。pRIP3：磷酸化受體相互作用蛋白3 圖6 pMLKL 免疫熒光檢測（×400） 紅色熒光斑點表示pMLKL蛋白。陰性對照組細胞無明顯熒光斑點，干擾素γ組、TRAIL組細胞膜可見淺紅色熒光斑點，細胞因子聯合組細胞膜可見明顯紅色熒光斑點。pMLKL：磷酸化混合系激酶區域樣蛋白

在程序性壞死中，RIP1 可能通過自身磷酸化實現對 N 端激酶的調控［11-12］，激活 RIP3，構成“RIP1-RIP3 壞死體”，同時在刺激因子作用下，RIP3 也發生自磷酸化，激活下游MLKL 使其磷酸化［3］，pMLKL 通過自身寡聚化后逐漸轉移至膜上［13-14］，可能通過對細胞膜的滲透、破壞，導致細胞死亡。本研究顯示，在陰性對照組、IFN-γ 組、TRAIL組之間 ，RIP3、MLKL基因表達及 RIP1、RIP3、MLKL 蛋白表達無明顯差異，細胞因子聯合組RIP3、MLKL 基因表達和RIP1、RIP3、MLKL 蛋白及其磷酸化蛋白表達均較陰性對照組明顯升高，證實 IFN-γ 和 TRAIL 聯合作用下 RIP1/RIP3/MLKL 信號通路被激活。zVAD 聯合組中，經過zVAD 預處理，caspase 8 表達降低，RIP1、RIP3、MLKL 及其磷酸化蛋白表達較細胞因子聯合組進一步上升，其程序性壞死程度進一步加深?？紤]到IFN-γ和TRAIL也可以參與炎癥反應、細胞凋亡等［6］，推測當caspase 8 被抑制時，IFN-γ 和 TRAIL 更易誘導程序性壞死發生。通過熒光顯微鏡可見，pMLKL 主要分布在細胞膜上，說明pMLKL 可能是HaCaT 細胞程序性壞死的執行者，通過對細胞膜完整性的破壞導致細胞死亡。既往研究發現，在人組織淋巴瘤細胞U937 和Fas 相關死亡域蛋白缺陷型人白血病T細胞系Jurkat 中，活性氧在MLKL 活化的上游和下游都起作用，一方面，活性氧促進“RIP1-RIP3 壞死體”穩定，并在程序性壞死過程中啟動正反饋擴增循環［15］，此外，活性氧可以特異性氧化 RIP1 上 3 個關鍵半胱氨酸［4］，從而促進S161自磷酸化和壞死體形成；另一方面，過度產生的活性氧可以損傷脂類、蛋白、DNA 等，影響 Ca2+濃度，引起細胞壞死［4，16］。本研究顯示，IFN-γ 和TRAIL 聯合作用可導致大量活性氧產生，說明在HaCaT 細胞程序性壞死中，活性氧也可能起重要作用，但這些仍需進一步研究。

本研究中，IFN-γ 單獨作用后細胞存活率明顯下降，但壞死率無明顯變化，其原因可能是IFN-γ單獨作用可誘導HaCaT 細胞發生凋亡［7］，而與TRAIL聯合作用時促程序性壞死作用明顯，考慮可能是IFN-γ 和TRAIL 細胞因子間相互作用所致。研究發現，藥物特異性CD8+T 細胞可產生IFN-γ，募集單核細胞/巨噬細胞和樹突細胞，進一步促進其他促炎細胞因子如 TRAIL 等表達［10，17］。此外，IFN-γ 可通過上調 KC 死亡受體 4、5 的表達，使 KC結合更多的TRAIL［11］，該機制可能也參與程序性壞死過程。還有研究發現，IFN-γ 可以打破細胞對TRAIL的耐受，增強細胞對TRAIL的敏感性［18］。

我們通過形態學分析以及細胞存活率、壞死率和程序性壞死相關基因和蛋白表達的檢測，證實IFN-γ 和 TRAIL 聯合可誘導 HaCaT 細胞發生程序性壞死，同時伴隨著活性氧產生，這些將有助于進一步理解SJS/TEN 中發生的KC 程序性壞死機制，以IFN-γ、TRAIL作為靶點的治療也許可減少KC大量壞死，緩解病情。鑒于SJS/TEN發病機制的復雜性，SJS/TEN中KC發生的程序性壞死是否有TNF-α等其他細胞因子參與以及RIP1/RIP3/MLKL通路與活性氧的具體作用等還需要深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突