改良熒光染色法在皮下真菌病組織病理診斷中的應用分析

劉曉雨 梁官釗 郭健 段昕所 李保強 徐伊 王淑新 陸潔

1承德醫學院附屬醫院皮膚科，河北 067000；2中國醫學科學院 北京協和醫學院皮膚病醫院真菌科，南京 210042

皮下真菌病往往需通過組織病理檢查來確診，傳統的染色方法主要有蘇木精-伊紅（HE）、過碘酸-雪夫（PAS）和六銨銀（GMS）染色法，這些方法操作步驟繁瑣、耗時長、標本易污染，漸難以滿足日益增加的臨床需求［1-2］。隨著熒光顯微鏡的普及，Calcofluor White（CFW）熒光染色劑開始被應用于真菌染色［3］。CFW 熒光染色劑有助于快速、靈敏、特異地檢出真菌，目前主要應用于涂片標本的直接鏡檢［3-4］，尚無用于皮下真菌病組織病理診斷的相關研究。本研究創新性地將CFW染色應用于皮下真菌病的組織病理診斷，通過比較改良CFW 熒光染色法、HE染色法、PAS染色法和GMS染色法檢測皮下真菌病真菌的陽性率，分析改良CFW 熒光染色法在皮下真菌病組織病理診斷中的應用價值，為皮下真菌病的診斷提供一種新的方法。

對象與方法

一、對象

回顧1987—2017年承德醫學院附屬醫院收治的21例皮下真菌病患者，其中女7例，男14例。感染部位位于頭面部2 例，上肢14 例（手部10 例，前臂4例），下肢5例（足背1例，腿部4例）。感染菌種為孢子絲菌12例，著色芽生菌3例，念珠菌1例，石膏樣癬菌1例，毛霉菌1例，菌種不明3例。所有患者均進行過組織病理檢查。納入標準：①住院期間疑診為真菌感染，切取局部活組織和組織病理診斷并留有病理組織蠟塊；②病理組織蠟塊中組織保留較多，能夠切取足量可用切片；③住院期間在切取組織相同部位取皮下組織行真菌培養陽性或組織病理切片行HE、PAS、GMS染色中任意一種染色真菌陽性。

二、主要試劑

0.1%CFW 工作液（美國Sigma 公司），HE 染色劑（珠海貝索生物技術有限公司），PAS 染色劑（北京雷根生物技術有限公司），GMS染色劑（珠海貝索生物技術有限公司）。陰性對照染色劑為10%KOH（天津永大化學試劑有限公司）。

三、方法

收集的石蠟包埋組織進行平行試驗，每塊組織連續切 4 張 4 μm 切片，1 張行改良 CFW 熒光染色，另3 張分別按常規行HE 染色、PAS 染色和GMS染色。

改良CFW熒光染色：石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水稍洗，切片晾干；滴加CFW 熒光染色液，避光染色10 min；傾去染液，蒸餾水稍洗，行常規HE染色；蒸餾水稍洗，常規脫水、透明、中性樹膠封固，熒光顯微鏡下鏡檢。

陰性對照：以蒸餾水代替熒光染色液及KOH溶液，其余步驟同改良CFW熒光染色。

四、結果判定

改良CFW 染色陽性：熒光顯微鏡下菌絲及孢子呈亮藍色，高倍鏡下或可見菌絲分隔，背景黑暗。HE 染色陽性：可見真菌孢子呈橢圓形。PAS染色陽性：真菌孢子呈橢圓形，孢子壁呈現紅色或紫紅色；真菌菌絲呈現紅色或紫紅色，菌絲不完整，呈節段性。GMS 染色陽性：細胞和組織背景為紅色，真菌孢子、菌絲呈黑褐色或棕褐色，孢子圓形或橢圓形。

五、統計學方法

采用SPSS 19.0軟件，4種染色法診斷真菌感染陽性率比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、4種染色方法檢出皮下真菌病的陽性率

21 例皮下真菌感染患者中，培養陽性17 例（80.95%），改良CFW 熒光染色法檢出陽性14 例（66.67%），HE 染色法陽性5例（23.80%），PAS 染色法陽性 6 例（28.57%），GMS 染色法陽性 11 例（52.38%）。改良CFW 熒光染色法陽性率高于HE染色（χ2= 6.718，P= 0.012）和 PAS 染色法（χ2=5.200，P= 0.029）。改良 CFW 熒光染色法與 GMS染色法陽性率差異無統計學意義（χ2= 0.693，P=0.530）。

二、4種染色方法的鏡下表現

在紫外激發光（紫外線濾鏡）下，經改良CFW染色法染色，孢子絲菌、念珠菌及未知菌種感染皮下組織中可見呈亮藍色菌絲及孢子，背景黑暗，真菌的形態特征清晰、明顯，陰性對照組背景黑暗，無熒光反應（圖1）。1份標本HE、PAS、GMS染色均呈陰性，而改良CFW染色法呈陽性（圖2）。在4種染色方法均為陽性的4份標本中，改良CFW染色法與其余染色方法相比，真菌形態特征更清晰，與背景反差更明顯（圖2）。

著色芽生菌在HE、PAS、GMS染色法中可以相對容易找到，使用改良CFW 熒光染色法在紫外激發光下隱約可見硬殼小體的黑色輪廓，并非亮藍色。見圖2。

討 論

深部真菌感染患者病死率隨治療開始時間的滯后而增高，及早給予經驗治療能挽救更多患者的生命，因此真菌感染的早期診斷是抗真菌治療成敗的關鍵［5］。在組織中判斷是否存在真菌感染，主要依靠病理石蠟切片的HE 染色及其他特殊染色，如GMS 及PAS 染色，再結合形態學進行判斷。HE 染色雖能顯示真菌本身顏色和周圍組織結構，但難以形成明顯對比，尤其對無色真菌的辨認較差。GMS染色法涉及的試劑品種繁多，且染液需即用即配，染色過程繁復，如過染會導致其他組織成分著色，影響結果判定。PAS 染色法可能造成切片中組織細胞的共染現象，配置染液及染色過程繁瑣，且無法染色部分菌種［6-8］。因此，探索新的染色方法，對于提高真菌感染的檢查效率與檢出率十分必要。

圖1 不同真菌感染皮下組織及陰性對照經改良熒光染色的鏡下表現（×400） 1A～1C：分別為孢子絲菌感染、念珠菌感染、未知真菌感染，組織中清晰可見呈亮藍色的菌絲及孢子；1D：陰性對照，無熒光反應

圖2 皮下真菌病組織標本改良熒光染色（CFW）、蘇木精-伊紅（HE）、過碘酸-雪夫（PAS）和六銨銀（GMS）染色的鏡下表現（×400） 孢子絲菌感染皮下組織改良CFW染色，真菌成分呈陽性，而HE、PAS、GMS染色均呈陰性。菌種未明確的某一真菌感染組織CFW染色，孢子染成亮藍色，與黑暗背景對比明顯；HE染色孢子呈淡黃色，PAS染色孢子呈紫紅色，GMS染色孢子呈棕黑色。著色芽生菌感染的皮下組織CFW染色可見孢子呈黑色輪廓，HE染色可見厚壁著色孢子，PAS染色孢子呈紫紅色，GMS染色孢子呈棕黑色

CFW 是一種二苯乙烯類化合物，能夠非特異性地結合真菌細胞壁的多種成分，如幾丁質和纖維素的β 葡聚糖等。在355 nm 紫外光激發下，經CFW 染色的真菌會迅速發出亮藍色熒光，而其他組織成分呈暗淡的灰藍色。CFW染色法早已成為國外實驗室檢測真菌的常用方法，其對培養真菌的染色能力最早于1962年被報道［9］，隨后在石蠟切片和冰凍切片中的應用也得到證實［4］。國外多個研究證明［3，10-11］，CFW 熒光染色法對卡氏肺孢子蟲囊腫、頭癬和白念珠菌感染具有很高的敏感性和特異性。目前國內CFW熒光染色法在真菌病診斷上的應用尚處于起步階段，研究也較為局限。楊通等［12］在21 例深部真菌病（包括鼻咽、食管、胃竇、肺部、膀胱）的組織病理檢測中，對比GMS 和PAS 染色法，CFW 熒光染色法的符合率達100%，且操作更簡單易行。羅云鵬等［13］在淺部真菌病的診斷研究中指出，特敏增強熒光染色的檢出率顯著高于KOH 濕片法，也高于CFW 熒光染色。而在皮下真菌病的組織病理診斷上，國內尚無相關研究的報道。

我們應用改良CFW熒光染色法檢測21例皮下真菌病患者組織中的真菌成分，以HE、PAS和GMS染色法為對照，發現改良CFW 熒光染色法陽性率高于傳統的HE、PAS 染色法。雖然改良CFW 熒光染色法與GMS 染色法在統計學上無顯著性差異，但改良CFW熒光染色法步驟簡單，操作簡便，有更高的實用性。CFW 熒光染色法在紫外激發光下，鏡下菌絲及孢子呈亮藍色，背景黑暗，與其他染色方法相比較，真菌的形態特征清晰、明顯。在著色芽生菌等暗色真菌的檢出上，由于其硬殼小體結構致密，其成分主要是葡聚糖，幾丁質含量少，而CFW熒光染色劑主要結合的是真菌胞壁中的幾丁質，在熒光顯微鏡下幾乎不能觀察到亮藍色熒光。這個結果同 Harrington與 Hageage［4］的研究結果一致。

本實驗取材來源于我科1987—2017年30年間收集的皮下真菌病標本，部分組織病理取材年限較久遠，蠟塊保存欠佳，實驗中需多次取材方可得到較為完整的病理組織，由于病理切片層次、部位不同，可能導致實驗存在假陰性。受組織固定液不同批次等影響，染色效果可能受到一定影響；且科室尚不具備菌種小培養條件，部分組織大培養陽性，但無法進一步準確確定菌種。本研究21例皮下真菌病患者中，CFW染色法陽性率最高，檢出14例陽性，7例陰性。假陰性結果可能來自于多次重復切片導致組織真菌成分遺失；實驗操作步驟不夠熟練，對各個過程時間把握欠佳；組織學讀片經驗有限等。過度讀片，將皮膚組織中的彈力纖維、膠原纖維、染色過程中混入的棉物纖維等與真菌成分相混淆等可能造成假陽性結果。本實驗病理取材例數相對較少，尚需要進行大數據研究，為臨床應用提供更多的參考。

綜上，改良Calcofluor White熒光染色法是一種準確、實用的真菌組織病理學診斷方法，雖前期投入相對較高，但其應用不僅限于診斷，更可以拓展到真菌病的治療。

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