IL-22對骨髓來源巨噬細胞相關炎癥因子表達的影響①

冼小龍 羅 薇 胡榜利 覃山羽 蘇思標 姜海行

(廣西醫科大學第一附屬醫院消化內科,南寧 530021)

肝纖維化是肝臟慢性炎癥時引發持續性損傷修復反應，導致肝組織內細胞外基質異常沉積，進一步引發肝臟結構改變和肝功能異常的一種病理過程，嚴重者可發展為肝硬化[1]。巨噬細胞在肝纖維化發展過程中發揮著重要作用[2]。目前將巨噬細胞分成兩型，即促炎型(M1型巨噬細胞)和抗炎型(M2型巨噬細胞)。由脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)或干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)活化可形成M1型巨噬細胞，M1型巨噬細胞能產生炎癥細胞因子，如腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-1β、IL-6等，招募集成纖維細胞和其他炎癥細胞，進而促進肝纖維化的進程[3]。

IL-22屬于IL-10家族，是新近發現的一種免疫介質，主要由激活的Th22、Th17、Th1、NK、NKT等細胞分泌[4]。已有研究證實，IL-22誘導肝星狀細胞(Hepatic stellate cells，HSC)凋亡，抑制肝纖維化進展，具有保護肝細胞的作用[5,6]。目前IL-22在肝臟中的研究多集中于肝細胞和HSC，但對巨噬細胞的研究鮮有報道。因此，本研究重點探討IL-22對LPS誘導的骨髓來源巨噬細胞相關炎癥因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料 C57BL/6小鼠(6～8周，雄性)，體重18～22 g，SPF級，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號:SYXK(桂)2014-0002。細胞培養基DMEM，胎牛血清(美國Gibco);青鏈霉素(北京索萊寶)；M-CSF，rmIL-22(美國R&D)；脂多糖(美國Sigma)；乳膠微球(1 μm,美國Sigma)；ACCUTASE細胞消化液(加拿大StemCell)；Stain Buffer(FBS)，Fixation/Permeabilization Solution Kit，流式細胞儀FACSCantoⅡ(美國BD)；FITC標記CD11b抗體，PerCP-Cyanine5.5標記F4/80抗體，PE標記iNOS抗體(美國ebioscience)；總RNA提取試劑盒(上海生物工程)；HiScript?Ⅱ One Step RT-PCR Kit(南京諾唯贊生物科技)；小鼠IL1-β、TNF-α ELISA檢測試劑盒(武漢華美生物工程)。

1.2方法

1.2.1骨髓來源巨噬細胞的獲取及M1型巨噬細胞的體外誘導 參考Weng等[7]的方法，頸椎脫臼法處死小鼠，75%酒精浸泡5 min,盡快將股骨與肌肉組織分離,用冰冷的PBS反復沖洗，將股骨從中間剪成兩段，用1 ml注射器吸取冰冷的PBS沖出骨髓，輕輕反復吹散細胞,以1 500 r/min離心5 min 棄上清，用2 ml 紅細胞裂解液重懸以裂解紅細胞，1 min后立即加入20 ml DMEM,充分混勻,過400目細胞篩，再以1 500 r/min 離心5 min，棄上清,沉淀用冰冷的PBS重懸清洗細胞2次,用含M-CSF(50 ng/ml)的DMEM完全培養基(含1%雙抗和10%胎牛血清)重懸細胞，計數按1×106個/ml細胞接種于6孔板，培養3 d后，重新換含M-CSF(50 ng/ml)的DMEM完全培養基再培養4 d。第7天換不含M-CSF的DMEM完全培養基去除非貼壁細胞，貼壁細胞即為骨髓來源巨噬細胞(M0型巨噬細胞)。LPS(1 μg/ml)刺激M0型巨噬細胞24 h，誘導形成M1型巨噬細胞。光鏡觀察M0及M1巨噬細胞形態。

1.2.2吞噬功能實驗 培養于6孔板內的骨髓巨噬細胞加入1 μl帶熒光標記的乳膠微球，在細胞培養箱中繼續培養2 h，用PBS洗掉未被骨髓巨噬細胞吞噬的乳膠微球，再用光鏡和熒光顯微鏡觀察骨髓巨噬細胞的吞噬功能。

1.2.3流式細胞術檢測骨髓來源巨噬細胞的純度及M1型巨噬細胞的比例 用ACCUTASE細胞消化液消化細胞并計數后，按1 ×106個/ml分裝至EP管中,1 500 r/min離心5 min，PBS洗1遍,離心后棄上清,用FBS重懸細胞,加入FITC標記CD11b抗體和PerCP-Cyanine5.5標記F4/80抗體，4℃避光染色30 min,PBS洗1遍，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入Fixation/Permeabilization固定/破膜液500 μl,4℃固定15 min，加入3 ml Perm/Wash液洗1遍，1 500 r/min離心5 min棄上清,以Perm/Wash液重懸細胞，加入PE標記iNOS抗體，4℃避光染色30 min,PBS洗1遍，1 500 r/min離心5 min棄上清，用200 μl PBS重懸后用流式細胞儀檢測。

1.2.4CCK8法檢測IL-22對細胞活性的影響 骨髓來源巨噬細胞懸液(1×104個/ml)接種至96孔板(100 μl/孔)，用不同濃度IL-22處理細胞36 h后，每孔加CCK8試劑10 μl，37℃溫育2 h，酶標儀測定450 nm處的OD值，按以下公式計算細胞增殖率：細胞增殖率(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(未加藥)-A(空白)]×100%。

1.2.5ELISA檢測巨噬細胞上清液IL1-β、TNF-α的分泌水平 收集巨噬細胞培養上清液，檢測IL1-β、TNF-α的分泌。按照試劑盒說明操作，加入配好的標準品和樣品，37℃溫育2 h，倒掉液體，加生物素標記抗體混勻，37℃溫育1 h，洗3次，加辣根過氧化物酶標記的親和素工作液，37℃溫育1 h，洗5次，加TMB底物，37℃溫育15～30 min，加終止液終止反應，5 min內讀板，450 nm波長檢測吸光度。

1.2.6RT-PCR檢測巨噬細胞iNOS、IL-1β、TNF-α的mRNA表達水平 按總RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA。按照HiScript?Ⅱ One Step RT-PCR Kit說明書進行實時熒光定量RT-PCR檢測。擴增條件：逆轉錄95℃ 3 min(1個循環),預變性95℃ 5min(1個循環)，95℃ 10 s 、60℃ 30 s (40個循環)。以GAPDH為內參照基因，采用2-ΔΔCt計算iNOS、IL-1β、TNF-α的mRNA相對表達量，引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列Tab.1 Primers for target gene

1.3統計學處理 采用SPSS22.0軟件對數據進行統計分析，兩組間均數差異比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法；P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1骨髓來源巨噬細胞的形態觀察 M0型巨噬細胞形態較圓，高亮，部分不規則形，偽足較少，見圖1A；M1型巨噬細胞體積略增大，胞質有空泡，顏色變深，偽足增多，呈煎蛋樣，見圖1B。

2.2骨髓來源巨噬細胞的吞噬功能 通過熒光顯微鏡觀察骨髓來源巨噬細胞吞噬率達99%(吞噬率%=吞噬乳膠微球細胞數/細胞總數)，說明誘導的骨髓巨噬細胞具備正常的吞噬功能，見圖2。

2.3不同濃度IL-22對骨髓來源巨噬細胞活力的影響 分別以2.5、5、10、20、40、80、160 ng/ml濃度的IL-22干預骨髓來源巨噬細胞36 h后，計算半抑制濃度值(IC50)，結果顯示IL-22對骨髓來源巨噬細胞的IC50為88.1 ng/ml,因此本實驗選擇IL-22的作用濃度為20 ng/ml，處于安全藥物濃度范圍內，見圖3。

2.4IL-22可抑制M1型巨噬細胞標志物的表達 經過7 d的誘導，CD11b+F4/80+細胞的比例為(99.3±0.4)%，成功獲得高純度的成熟M0型巨噬細胞，見圖4A。用LPS(1 μg/ml)刺激M0型巨噬細胞24 h，檢測M1型巨噬細胞標記物CD11b+F4/80+iNOS+，實驗結果顯示CD11b+F4/80+iNOS+細胞的比例為(85.9±4.1)%，成功獲得M1型巨噬細胞。IL-22(20 ng/ml)干預M1型巨噬細胞36 h后，分別檢測LPS組、LPS+IL-22組M1型巨噬細胞標記物，結果顯示，LPS+IL-22組CD11b+F4/80+iNOS+細胞的比例為(68.8.9±2.6)%，低于LPS組(P<0.01)，差異具有統計學意義，見圖4B。

2.5IL-22可抑制M1型巨噬細胞IL-1β、TNF-α的分泌 IL-22干預M1型巨噬細胞36 h后，分別檢測兩組M1型巨噬細胞IL-1β、TNF-α分泌水平，結果顯示，與LPS組相比，LPS+IL-22組促炎細胞因子IL-1β[(431±47)vs(296±55)pg/ml，t=3.214，P=0.032]和TNF-α[(629±74)vs(274±24)pg/ml，t=7.896，P=0.001]分泌水平均降低，差異具有統計學意義，見圖5。

2.6IL-22可抑制M1型巨噬細胞iNOS、IL-1β、TNF-α的mRNA表達 IL-22不同時間(12、24和36 h)干預M1型巨噬細胞，分別檢測M1型巨噬細胞相關炎癥因子iNOS、IL-1β、TNF-α的mRNA表達水平，結果顯示，與LPS組相比，LPS+IL-22組的促炎細胞因子iNOS、IL-1β、TNF-α的mRNA表達均有不同水平地降低，其中，TNF-α mRNA表達水平隨著IL-22干預時間延長而下降(P<0.01)；IL-1β和iNOS的24 h和36 h組mRNA表達水平降低(P<0.05)；差異均具有統計學意義， 而iNOS 12 h組mRNA表達水平升高(P>0.05)，差異無統計學意義。實驗結果證實IL-22可抑制巨噬細胞相關炎癥因子的分泌，抑制炎性反應，見圖6。

圖1 骨髓來源巨噬細胞形態(×200)Fig.1 Morphology of bone marrow-derived macrophagesNote: A.M0 macrophages;B.M1 macrophages(×200).

圖2 骨髓來源巨噬細胞吞噬乳膠微球(×200)Fig.2 Phagocytosis of latex beads by bone marrow-derived macrophages(×200)

圖3 不同濃度IL-22對骨髓來源巨噬細胞活力的影響Fig.3 Effects of different concentrations of IL-22 on viability of bone marrow-derived macrophages

圖4 骨髓來源巨噬細胞的流式細胞術分析Fig.4 Flow cytometry analysis of bone marrow-deriv-ed macrophagesNote: A.Bone marrow-derived macrophages were first gated on FSC and SSC to remove debris and conjugates,mature M0 macrophages were defined as CD11b+F4/80+ subpopulations;B.M0 macropha-ges were induced by LPS for 24 h,and then treated with IL-22 for 36 h,M1 macrophages were defined as CD11b+F4/80+iNOS+ subpopulations;Compared with LPS group,**.P<0.01.

圖5 IL-22干預36 h對M1型巨噬細胞的IL-1β、TNF-α分泌水平的影響Fig.5 Effects of IL-22 on secretion of IL-1β and TNF-α in M1 macrophages after 36 h interventionNote: Compared with LPS group,*.P<0.05，**.P<0.01.

3 討論

肝纖維化是一種肝內彌漫性細胞外基質過度沉積的病理過程[8]。肝纖維化的形成過程中，炎性反應發揮關鍵性作用。枯否細胞是位于肝竇內的巨噬細胞，與其它炎癥細胞如浸潤性巨噬細胞、T淋巴細胞、嗜中性粒細胞和樹突狀細胞都會導致肝臟炎癥，炎癥細胞激活HSC，進而導致肝纖維化[9,10]。在本研究中，從股骨分離得到的骨髓干細胞經過M-CSF7 d的分化培養，CD11b+F4/80+細胞的比例非常高，與Ying等[11]的結果一致。本研究還通過吞噬乳膠微球實驗證實了M-CSF誘導的巨噬細胞具備正常的吞噬功能。巨噬細胞分為促炎型(M1)和抗炎型(M2)。由IFN-γ和LPS誘導并表達促炎癥細胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β的M1型巨噬細胞參與肝纖維化的發病機制。M2型巨噬細胞由IL-4、IL-10和IL-13誘導并可分泌細胞因子IL-10、TGF-β、PDGF和EGF，M2型巨噬細胞具有抗炎作用，促進傷口愈合[12]。本研究用LPS刺激骨髓來源巨噬細胞后，得到高比例的CD11b+F4/80+iNOS+細胞，該細胞高度表達相關促炎因子iNOS、IL-1β、TNF-α的mRNA，同時IL-1β和TNF-α的分泌量增多，呈典型的M1型巨噬細胞炎癥模型。

圖6 IL-22不同的干預時間對M1型巨噬細胞的iNOS、IL-1β和TNF-α mRNA表達的影響Fig.6 Effects of different intervention time on expression of iNOS,IL-1β and TNF-α mRNA in M1 macrophagesNote: Compared with LPS group,*.P<0.05，**.P<0.01.

IL-22在調節炎性疾病相關的炎性反應中具有重要作用[13],在控制細菌感染、調節內穩態和對抗組織損傷等方面均具有重要作用[14]。在肝臟體內和體外的研究中，IL-22通過STAT3對酒精性肝損傷起保護作用，參與肝切除術后肝增殖再生，在急性肝臟炎癥期間為肝細胞提供保護[5,15,16]。研究發現，IL-22與HSC上的IL-22R1受體結合后夠誘導HSC的衰老，加速肝纖維化溶解，減輕纖維化程度;而STAT3、SOCS3、P53和Notch信號通路的激活可能是IL-22誘導HSC的凋亡、抑制肝纖維化進展的主要機制[6]。但在肝臟研究中，對IL-22與巨噬細胞炎癥關系的研究少有報道。在本研究中，用IL-22干預M1型巨噬細胞，發現IL-22可不同水平抑制M1型巨噬細胞相關促炎因子iNOS、IL-1β和TNF-α的mRNA表達，而且抑制作用隨著時間而遞增，IL-22減少M1型巨噬細胞的比例，降低細胞TNF-α、IL-1β的上清分泌水平。這一結果表明，IL-22可以作用于巨噬細胞，減少其炎性反應。Luo等[17]的研究提示，肝纖維化組織中M1比M2型巨噬細胞數量多，IL-22可促進M0型巨噬細胞向M2型巨噬細胞分化，并上調STAT3表達水平，推測IL-22可能經STAT3通路調控巨噬細胞來抑制肝纖維化發生發展。結合本研究猜想，IL-22可能通過STAT3通路減少M1型巨噬細胞比例，促進M2型巨噬細胞的分化，從而減輕炎癥和發揮抗炎修復作用。

綜上所述，經LPS刺激的骨髓來源巨噬細胞，細胞炎癥水平增高，IL-22可抑制其促炎癥因子的表達，減少M1型巨噬細胞比例，發揮抑炎作用。