DAB 2IP和 β-catenin在胃癌組織中的表達及臨床意義

宋志明，高明，王穎霞，申麗娟

鄭州大學第一附屬醫(yī)院1康復醫(yī)學科，2腫瘤科，鄭州 450052

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。根據中國癌癥流行病學的統(tǒng)計數(shù)據顯示，盡管中國胃癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，但由于中國的人口基數(shù)龐大，且老齡化速度加快，胃癌仍是僅次于肺癌的具有高發(fā)病率和高病死率的惡性腫瘤[1]。胃癌的起病較為隱匿，當胃癌患者出現(xiàn)疼痛、惡心、嘔吐和消瘦等臨床癥狀時常已進展至中晚期。既往研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)生、發(fā)展受多基因、多因子的調控，但目前仍缺乏被廣泛認可的特異性腫瘤標志物，因此，尋找快速、有效的胃癌診斷和預后評估生物學指標是目前的研究熱點[2]。人DAB2相互作用蛋白（disabled homolog 2-interacting protein，DAB2IP）是Ras-鳥苷三磷酸酶激活蛋白（Ras guanosine triphosphatase activating protein，Ras-GAP）家族的成員之一，能夠通過介導多種信號通路調控細胞的周期，并抑制腫瘤的生長、分化及新血管的生成[3]。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是上皮鈣黏素-連環(huán)素復合體的重要組成部分，具有細胞黏附和識別的雙重功能，是WNT信號轉導通路的關鍵分子，在WNT靶基因介導的細胞增殖、分化及腫瘤的浸潤和侵襲過程中發(fā)揮著重要的作用[4]。Xie等[5]進行了關于前列腺癌的研究，發(fā)現(xiàn)DAB2IP可通過調節(jié)糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）-β-catenin信號通路誘導上皮-間充質干細胞的轉化。朱鵬武等[6]發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中DAB2IP和β-catenin的異常表達與胃癌的臨床分期、浸潤深度和淋巴結轉移情況有關。但目前關于DAB2IP和β-catenin在胃癌組織表達的相關性及與患者臨床特征的關系仍鮮有報道。基于以上研究背景，本研究擬對行胃癌根治術的95例患者的術后標本進行DAB2IP和β-catenin陽性率的檢測，旨在分析DAB2IP和β-catenin在胃癌患者胃癌組織中的陽性表達情況及其對患者預后的評估價值，為進一步探索二者在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的潛在分子學機制奠定基礎。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取

選取2008年7月至2012年9月于鄭州大學第一附屬醫(yī)院治療的胃癌患者95例，留取其胃癌切除新鮮組織標本。95例胃癌患者的納入標準：①行胃癌根治術；②經術后病理學檢查證實為胃癌；③術前未行放療、化療、生物免疫治療或靶向治療；④既往無其他部位的腫瘤病史；⑤具備一定的聽、說、讀、寫能力。排除標準：①合并嚴重的心肝腎功能不全；②合并精神或認知功能障礙。95例胃癌患者中，男53例，女42例；年齡為34～79歲，平均年齡為（54.26±16.40）歲；組織學分化程度參照2000年世界衛(wèi)生組織（WHO）分類標準[7]：低分化53例，中高分化42例；TNM分期參照2002年國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會（Union for International Cancer Control/American Joint Committee on Cancer，UICC/AJCC）指南[8]：Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ～Ⅳ期52例。另選取同期30例胃癌患者（均隨機從95例胃癌患者的胃癌組織中選取）相應的癌旁正常黏膜組織（距腫瘤邊緣5 cm以上），均經病理學檢查證實為正常的胃黏膜組織。

1.2 免疫組織化學染色方法

所有標本均先采用10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水和石蠟包埋后，4 μm厚連續(xù)切片，并行常規(guī)蘇木精-伊紅染色和病理學檢查。具體染色方法：選取8張石蠟切片進行脫蠟和抗原修復，然后分別采用3%H2O2和正常動物血清封閉50 min，封閉結束后，將其中4張切片滴入兔抗人DAB2IP單克隆抗體（稀釋濃度1∶100，購于北京博奧森生物技術有限公司），4℃下孵育24 h；另外4張組織切片滴入鼠抗人β-catenin抗體（稀釋濃度1∶50，購于北京中杉金橋生物技術有限公司），4℃下孵育24 h；孵育完成后磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次，滴加生物素標記的二抗，37℃下孵育40 min后，PBS連續(xù)沖洗3次（＞5 min）；滴加鏈霉卵白素和辣根酶標記生物素復合物，37℃下孵育40 min后，PBS連續(xù)沖洗3次（＞5 min）；滴加氨基聯(lián)苯氮顯色液，常溫下顯色3～5 min，并用PBS替代一抗體作為陰性對照。

1.3 染色結果判定

DAB2IP陽性染色為主要定位于細胞質，出現(xiàn)淺黃色至棕褐色顆粒；β-catenin陽性染色主要定位于細胞膜，出現(xiàn)棕褐色細小顆粒狀。每張石蠟切片隨機選取10個高倍視野（×400），每個視野隨機計數(shù)100個細胞；采用半定量乘積法對染色結果計分。根據染色強度評分：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據陽性細胞所占百分比評分：＜6%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75為4分。最終按照兩項的乘積計算總分，總分≥3分為陽性，總分≤2分為陰性。

1.4 隨訪

主要采用微信群、電話和電子郵件的方式對患者進行隨訪，定期與患者預約門診復查的時間。從患者進行胃癌根治術為事件的起點，以隨訪中患者死亡或不明原因的失訪為終點事件。隨訪截止時間為2017年8月。

1.5 統(tǒng)計學分析

將實驗室和隨訪數(shù)據錄入Epidata 3.0軟件建立胃癌數(shù)據庫，并采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用 McNemarχ2檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用t檢驗；相關性分析采用Spearman秩相關分析；生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，生存時間的比較采用Breslow檢驗；采用Cox比例風險回歸模型對胃癌患者預后的影響因素進行單因素和多因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DAB 2IP和 β-catenin陽性表達情況的比較

β-catenin在胃癌組織中的陽性表達率為64.21%，明顯高于癌旁正常黏膜組織的36.67%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.083，P＜0.01）；DAB2IP在胃癌組織中的陽性表達率為49.47%，明顯低于癌旁正常黏膜組織的93.33%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=16.493，P＜0.01）。（表1）

表1 不同組織中DAB 2IP和 β-catenin陽性表達情況的比較 [n（%）]

2.2 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中DAB 2IP和 β-catenin陽性表達情況的比較

不同TNM分期、浸潤深度、遠處轉移情況和淋巴結轉移情況胃癌患者胃癌組織中DAB2IP陽性表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=12.943、8.255、6.281、11.533，P＜0.05）；不同年齡、性別、腫瘤最大徑、組織分化程度胃癌患者胃癌組織中DAB2IP的陽性表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。不同TNM分期、淋巴結轉移情況、分化程度和浸潤深度胃癌患者胃癌組織中β-catenin的陽性表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=9.820、7.224、11.043、8.119，P＜0.05）；不同年齡、性別、腫瘤最大徑和遠處轉移情況胃癌患者胃癌組織中β-catenin的陽性表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表2）

2.3 94例胃癌患者預后的影響因素分析

單因素分析結果顯示，DAB2IP表達（HR=0.35，95%CI：0.19～0.67）、年齡（HR=2.44，95%CI：1.15～5.14）、遠處轉移（HR=3.25，95%CI：1.05～10.10）、TNM分期（HR=2.35，95%CI：1.02～5.39）和β-catenin表達（HR=2.21，95%CI：1.20～4.10）可能與胃癌患者的預后有關（P＜0.05）（表3）。將上述5種有統(tǒng)計學意義的因素再次納入Cox比例風險回歸模型中進行多因素分析，結果顯示，有遠處轉移和DAB2IP陰性表達是影響胃癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.01）（表4）。

2.4 胃癌組織中DAB 2IP和 β-catenin表達的相關性

47例DAB2IP陽性表達的胃癌患者的胃癌組織中，β-catenin的陽性表達率為38.30%（18/47）；48例DAB2IP陰性表達的胃癌患者的胃癌組織中，βcatenin的陽性表達率為89.58%（43/48）。β-catenin在DAB2IP陰性表達組織中的陽性表達率明顯高于DAB2IP陽性組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。經Spearman相關性分析，DAB2IP和β-catenin在胃癌組織中的表達呈明顯負相關（r=-0.535，P＜0.01）。（表5）

表2 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中DAB 2IP和 β-catenin的陽性表達情況

表3 胃癌患者預后影響因素的單因素COX回歸分析

表4 胃癌患者預后影響因素的多因素COX回歸分析

表5 胃癌組織中DAB 2IP和 β-catenin表達的相關性（n=95）

2.5 DAB 2IP和 β-catenin表達與胃癌患者生存情況的關系

95例胃癌患者的中位隨訪時間為38個月（9～60個月）。47例DAB2IP陽性表達的患者中，12例（25.53%）患者死亡；48例DAB2IP陰性表達的患者中，23例（47.92%）患者死亡。DAB2IP陽性表達患者的生存時間為12～60個月，長于DAB2IP陰性表達患者的9～60個月，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.991，P=0.025）（圖1）。61例β-catenin 陽性表達的患者中，28例（45.90%）患者死亡；34例β-catenin陰性表達的患者中，7例（20.59%）患者死亡。β-catenin陰性表達患者的生存時間為9～60個月，長于陽性表達組患者的12～52個月，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.556，P=0.033）（圖2）。

圖1 DAB 2IP陽性表達（n=47）和DAB 2IP陰性表達（n=48）胃癌患者的生存曲線

圖2 β-catenin陽性表達（n=61）和 β-catenin陰性表達（n=34）胃癌患者的生存曲線

3 討論

DAB2IP又稱ASK1相互作用蛋白，是新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑癌基因，其定位于染色體9q33.1～q33.3上，由C2、RasGAP、PH和DUF四個結構域組成，共包含14個內含子和15個外顯子，可編碼967個氨基酸[9]。既往研究發(fā)現(xiàn)，DAB2IP能夠抑制前列腺癌、結直腸癌和胃癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，并參與多種腫瘤相關信號轉導過程的核心環(huán)節(jié)[3,5-6]。目前已有文獻報道，DAB2IP能夠介導MAER/細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路、細胞凋亡信號調節(jié)激酶 1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）-c-Jun氨基末端激酶1（c-jun N-terminal kinase 1，JNK1）通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路、磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）通路及GSK-3β-β-catenin通路等參與細胞的生長、分化和凋亡[10-11]。研究證實，DAB2IP在多種腫瘤細胞中的表達均下調。Dote等[12]研究認為，胃腸道腫瘤中DAB2IP表達的下調主要與啟動子5′區(qū)域的異常甲基化有關，且啟動子m2a和m2b區(qū)域的甲基化狀態(tài)與胃部腫瘤的發(fā)病位置有關。目前，關于DAB2IP在胃癌組織中表達情況及其與患者預后關系的報道仍較少見。本研究結果顯示，DAB2IP在胃癌組織中的陽性表達率明顯低于癌旁正常黏膜組織（P＜0.01）。這與王瀚等[13]研究的結果相似，其分析認為主要與胃癌組織中的DAB2IP表達受到抑制有關。另外，不同TNM分期、浸潤深度、遠處轉移情況和淋巴結轉移情況胃癌患者胃癌組織中DAB2IP表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且隨著TNM分期、浸潤深度的增加，陽性表達率降低。DAB2IP陽性表達與胃癌患者預后關系的研究結果顯示，DAB2IP陽性表達患者的生存時間長于DAB2IP陰性表達患者（P＜0.05）。Cox回歸分析顯示，遠處轉移和DAB2IP陰性表達是影響胃癌患者預后的獨立危險因素。上述結果均提示DAB2IP對胃癌患者的診斷和預后預測具有重要的價值，有望成為今后胃癌患者療效和預后評估的重要參考指標。

β-catenin是一種主要存在于細胞膜和細胞質中的單鏈多肽，主要由CTNNBl基因編碼，通常被認為是WNT信號轉導通路的主要組成部分[14]。在正常生理情況下，β-catenin主要被腫瘤抑制基因APC抑制而維持低水平狀態(tài)。WNT信號轉導通路的異常激活或APC的突變可導致細胞質內βcatenin大量積聚。既往相關研究表明，WNT/βcatenin信號轉導通路可通過調控多種效應分子從而參與胃癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉移過程[4,15]。本研究結果顯示，胃癌組織中β-catenin的陽性表達率明顯高于癌旁正常黏膜組織（P＜0.01），且不同TNM分期、淋巴結轉移情況、分化程度和浸潤深度胃癌患者胃癌組織中β-catenin表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這與Kaya等[16]以及陳超和姚莉敏[17]的研究結果相似。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin陰性表達患者的生存時間長于β-cateni陽性表達（P＜0.05）；單因素回歸分析結果顯示，βcatenin表達可能是胃癌患者預后的影響因素（HR=2.21，95%CI：1.20～4.10），上述結果均提示β-catenin也參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展和預后過程。但是，多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)β-catenin表達不是影響胃癌患者預后的獨立危險因素（P＞0.05），因此，關于β-catenin與胃癌患者預后的關系有待進一步深入研究。

目前，關于DAB2IP與β-catenin之間相互作用方式的研究仍較少。Xie等[5]進行的一項關于前列腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，當DAB2IP正常表達時，其分子結構中的C2結構域可與蛋白磷酸酶2A和GSK-3β相結合，誘導GSK-3β活化進而導致β-catenin表達下調，主要表現(xiàn)為GSK-3β-β-catenin信號轉導通路的阻斷。而前列腺癌細胞中DAB2IP沉默導致表達下調時，β-catenin的轉錄活性增強，導致過多的β-catenin積聚在細胞核內，加速其在細胞質中的降解進程，誘導上皮-間充質干細胞的轉化，從而增強腫瘤細胞的浸潤和轉移能力。Wu等[18]同樣研究發(fā)現(xiàn)，DAB2IP能夠阻斷WNT/β-catenin通路，誘導抗凋亡因子Clusterin表達，增加腫瘤細胞的抗藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中DAB2IP的陽性表達率低于癌旁正常黏膜組織，而β-catenin的陽性表達率高于癌旁正常黏膜組織（P＜0.05）。經Spearman相關性分析，二者在胃癌組織中的表達呈負相關（r=-0.535，P＜0.01），這可能提示DAB2IP也可通過GSK-3β-β-catenin信號轉導通路在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要的作用。

綜上所述，DAB2IP和β-catenin可作為胃癌診斷和預后評估的有效指標。兩者在胃癌組織中的異常表達與胃癌患者的TNM分期、組織分化程度、淋巴結轉移情況、遠處轉移情況和生存時間密切相關，且隨著兩者分子生物學交互作用的進一步闡明，可能為評估胃癌的生物學行為提供更多的標志物。當然，本研究仍存在不足之處，主要是納入的樣本量較小和隨機誤差的影響較大。因此，未來研究應進一步納入更多的胃癌患者并進行遠期生存情況的隨訪，同時對納入的患者進行治療方法或年齡的分層，以進一步證實DAB2IP和βcatenin在胃癌中的診斷和預后預測價值。