DESI2基因干擾聯合PI3K抑制劑對人胰腺癌細胞ASPC-1的影響

歐希，張光濤，徐喆，陳景森，謝勇，劉吉奎，劉曉平

（1.北京大學深圳醫院 肝膽胰外科，廣東 深圳 518036；2.深圳市第三人民醫院 肝病三區，廣東 深圳518112；3.深圳市婦幼保健院 乳腺科，廣東 深圳 518028）

細胞凋亡在腫瘤發病過程中（特別是在胰腺癌等惡性難治愈的腫瘤病變中）發揮著至關重要的作用[1]，一旦細胞凋亡的調控機制異常或者凋亡受到阻斷將會導致惡性腫瘤細胞的遷移與轉化[2]。系列研究表明，腫瘤細胞中多條通路可以導致細胞異常激活，阻斷細胞的正常凋亡過程，特別是AKT/mTOR信號通路，AKT蛋白中的T308和S473位發生磷酸化，會促進腫瘤的生長與分化，從而使腫瘤細胞表達失調，造成細胞過度增殖[3]。因此一些與AKT/mTOR信號通路相關的基因靶點藥物正在研發中，但是胰腺癌作為一種消化道高病死率的癌癥，單一的藥物或者基因阻斷不能很好地起到治療效果。為了避免胰腺癌這種治療抗拒，選擇聯合基因阻斷可以為增強胰腺癌治療效果提供新的途徑。人凋亡相關新基因DESI2（desumoylating isopeptidase 2，被人熟知的名稱是PNAS-4），是通過大規模測序獲得的一種新基因[4]，研究發現在肝癌和卵巢腫瘤中過表達DESI2基因都可以明顯觀察到腫瘤細胞的凋亡效應，腫瘤細胞活性明顯受到抑制[5-6]。還有報道表明，DESI2基因與AKT/mTOR信號通路有相互作用[7]，但是其作用機理暫無明確報道。因此在本實驗中我們構建DESI2慢病毒干擾載體，并轉入相應的胰腺癌細胞中，通過其與PI3K抑制劑聯合作用，觀察對胰腺癌細胞的生物學行為的影響及對胰腺癌細胞的殺傷效果。

1 材料和方法

1.1 細胞株及分組

ASPC-1細胞系購于上海中科院細胞庫。將ASPC-1細胞分為四組：（1）溶劑對照組；（2）PI3K抑制劑組；（3）DESI2干擾+PI3K抑制劑組；（4）DESI2空載+PI3K抑制劑組。各組轉染細胞使用Opti-MEM?培養基稀釋DNA，制備DNA預混液，然后添加P3000TM試劑充分混勻，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養。

1.2 試劑與儀器

Lipofectamine?3000（18882752，Invitrogen）；OPTI-MEM?I（331985-062，Gibco）；Ultrapure RNA超純RNA提取試劑盒（CW0581M，康為世紀）；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒（CW2569M，康為世紀）；Ul traSYBR Mixture（CW0957M，康為世紀）；Fluo 4-AM（F312，Dojindo）；超敏發光液（RJ239676，賽默飛）；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（TA-08，中杉金橋，1/2000）；Rabbit Polyclonal Anti-AKT（bs-2720R，Bioss，1/1500）；Rabbit Polyclonal Anti-P-AKT（bs-0876R，Bioss，1/1500）；Rabbit Monoclonal Anti-MTOR（ab32028，Abcam，1/1000）；Rabbit Polyclonal Anti-P-MOTR（Ser2448，Cell Signalingr，1/1000）；Rabbit Polyclonal Anti-PI3K（bs-2067R，Bioss，1/1500）；Rabbit Polyclonal Anti-P-PI3K（Tyr458，Cell Signalingr，1/1000）； Mouse Monoclonal Anti-Caspase3（bsm-33199M，Bioss，1/1000）；Rabbit Polyclonal Anti-DESI2（bs-19976R，Bioss，1/1000）；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（AP101-100-kit，MULTI SCIENCES聯科生物）；Cell Cycle Staining Kit（CCS012，MULTI SCIENCES聯科生物）；熒光細胞成像儀（ZOETM Bio-Rad）；蛋白垂直電泳儀（DYY-6C，北京市六一儀器廠），超高靈敏度化學發光成像系統[Chemi DocTM XRS+，伯樂生命醫學產品（上海）有限公司]；熒光PCR儀[伯樂生命醫學產品（上海）有限公司，CFX ConnectTM實時]；NovoCyteTM流式細胞儀[NovoCyte 2060R，艾森生物（杭州）有限公司]。

1.3 DESI2干擾載體的構建

NCBI查找DESI2的基因，根據其基因的CDS序列設計shRNA靶序列，正義鏈引入BamHI酶切位點，反義鏈引入EcoRI酶切位點，退火形成雙鏈，與載體pGreenpuro連接，構建慢病毒重組載體sh-DESI2-pGreenpuro。見表1。

1.4 細胞增殖檢測

采用MTT法。將5×MTT用Dilution Buffer稀釋成1×MTT，每孔加50 μL 1×MTT，在37 ℃孵育4 h，使MTT還原為甲臢，吸出上清液，每孔加150 μL DMSO使甲臢溶解，用酶標儀慢速振蕩搖勻；酶標儀在550 nm波長處檢測每孔的光密度。

表1 sh-DESI2序列

1.5 細胞周期及細胞凋亡檢測

采用流式細胞儀。細胞轉染48 h后，棄去培養液，PBS洗2次，加入胰蛋白酶消化1 min，加入含10%FBS的DMEM，將細胞吹打下來并吸取到1.50 mL離心管中，離心，棄去上清液，用PBS洗滌細胞兩次（2 000 r/min離心5 min），收集1×105～5×105細胞，再加入1 mL 70%的乙醇溶液，放入4 ℃條件下2 h進行細胞固定。每管加PBS 1 mL，混勻，8 000 r/min離心3 min，棄上清。加入1 mL DNA staining solution，渦旋振蕩5～10 s混勻。室溫避光孵育30 min。上機檢測，數據分析。

收集1×106～3×106個細胞，加1 mL PBS 1 500 r/min離心，3 min，洗兩遍。用雙蒸水將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer。取300 μL預冷的1×Binding Buffer重懸細胞。每管各加入3 μL Annexin V-FITC和5 μL PI-PE。輕微混勻后，室溫避光孵育10 min。再向每管中加入200 μL預冷的1×Binding Buffer。混勻后上流式細胞儀檢測。

1.6 細胞侵襲實驗

細胞種板前1 d，血清饑餓12 h，常規消化、離心收集細胞，用低血清DMEM培養液（含0.2% FBS）混懸成密度為5×105/mL的單細胞懸液。將Transwell培養池放入24孔培養板中，上室內加入100 μL細胞懸液（約5×104細胞），下室內加入500 μL含10% FBS的DMEM培養液。置于5% CO2、37 ℃孵箱培養24 h后，PBS洗2次，用棉球小心擦去上室內細胞，4%多聚甲醛固定20～30 min，PBS洗2次，0.1%結晶紫染色30 min，PBS洗2次，去掉多余染料，顯微鏡下觀察拍照。

1.7 qRT-PCR檢測各基因的mRNA表達情況

取各組細胞進行RNA的提取，提取RNA后根據逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進行檢測，以GAPDH為內參，算出各組細胞中DESI2、AKT、Caspase3、mTOR和PI3K的相對表達量。引物序列見表2。

表2 引物序列

1.8 Western blotting檢測各蛋白表達情況

取各組細胞加入組織裂解液，裂解30 min后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，小心吸取上清，即可獲得總蛋白。根據BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后上樣，再進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉膜30～50 min。4 ℃孵育一抗過夜；二抗溶液中室溫孵育1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統中曝光。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1DESI2干擾載體的鑒定及效果驗證

慢病毒重組載體轉化感受態細胞，給予菌落PCR驗證，理論上會得到629 bp大小的條帶，由圖1可知，電泳結果與理論值相符，均有陽性點。利用熒光定量PCR方法檢測三條干擾序列中最具有干擾效果的序列，如圖2A所示，三條干擾序列中sh-DESI2(3)具有干擾效果，因此選擇sh-DESI2(3)進行以下實驗。如圖2B所示，與對照組相比，DESI2空載組的DESI2表達明顯升高，DESI2干擾組則明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 各組細胞增殖情況

如圖3所示，與對照組相比，PI3K抑制劑組和DESI2空載+PI3K抑制劑組，細胞的增殖受到抑制；與PI3K抑制劑組相比，DESI2干擾+PI3K抑制劑組細胞活性明顯升高。

圖1 菌落PCR電泳圖

圖2 DESI2干擾載體效果的驗證

2.3 各組細胞周期變化情況

如圖4所示，與對照組相比，PI3K抑制劑組和DESI2空載+PI3K抑制劑組細胞活性明顯下降，G1期比例升高，S期和G2期比例降低。與PI3K抑制劑組相比，DESI2干擾+PI3K抑制劑組細胞活性明顯升高，G1期比例降低，S期比例升高。與對照組相比，PI3K抑制劑處理ASPC-1細胞可以抑制細胞增殖；而PI3K抑制劑處理DESI2干擾的ASPC-1細胞可以促進細胞增殖。

2.4 各組細胞凋亡情況

圖3 MTT檢測結果

如圖5所示，與對照組相比，PI3K抑制劑組和DESI2空載+PI3K抑制劑組的凋亡明顯升高；與PI3K抑制劑組相比，DESI2干擾+PI3K抑制劑組細胞的凋亡明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 各組細胞侵襲情況

如圖6所示，與對照組相比，PI3K抑制劑組和DESI2空載+PI3K抑制劑組的細胞侵襲明顯下降；與PI3K抑制劑組相比，DESI2干擾+PI3K抑制劑組細胞侵襲明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.6 各組細胞中的DESI2、AKT、PI3K、mTOR、Caspase3 mRNA和蛋白的表達結果以及p-AKT、p-PI3K、p-mTOR蛋白表達結果

與對照組相比，PI3K抑制劑組和DESI2空載+PI3K抑制劑組Caspase3 mRNA和蛋白表達升高，AKT、PI3K和mTOR及其磷酸化的蛋白表達量明顯下降；與PI3K抑制劑組相比，DESI2干擾+PI3K抑制劑組Caspase3 mRNA和蛋白表達下降，AKT、PI3K和mTOR及其磷酸化的蛋白表達量明顯升高。見圖7。

3 討論

圖4 各組細胞周期變化

基因靶向藥物是腫瘤最新的治療方式，靶點的選擇和抗藥性是其中的難點也是胰腺癌難以治療和根治的主要原因之一[8]。如何解決藥物的耐藥性以及提高治療的有效性是人們當前研究的熱點。2002年美國國立衛生研究院在大規模測序中鑒定出一種新基因：DESI2基因，它定位于人染色體1q44，并且有5個外顯子，可以編碼1個由194個氨基酸殘基組成的蛋白[9]。DESI2基因是一種促凋亡基因，有研究表明，DESI2不僅與機體生長發育相關，并且還參與了多種腫瘤的生物學行為[10]。有研究發現，DESI2基因在結直腸癌、肺癌等腫瘤中的表達均明顯下降，可能DESI2基因在多種腫瘤中起著抑制腫瘤發生的作用[11-12]。AKT/mTOR是經典的信號通路之一，參與細胞生長、增殖、分化調節等各方面[13]。研究發現，活化的PI3K可以使AKT磷酸化而生成p-AKT，p-AKT進一步磷酸化其下游的酪氨酸和色氨酸殘基，從而激活下游因子，抑制胰腺癌細胞的凋亡，促進細胞周期的運行，增加腫瘤血管形成和侵襲、轉移的效果[14-17]，因此通過采用PI3K抑制劑可以有效促進腫瘤細胞的凋亡通路的開啟，其作用機理可能是通過調控腫瘤細胞中Caspase3蛋白的生成從而影響腫瘤細胞的凋亡過程[18]，本研究與其結果類似，但是單一的抑制劑效果有限，因此需要尋找其相互作用的基因進一步來促進腫瘤細胞的凋亡以達到腫瘤治療的效果和效率。

圖5 各組細胞凋亡變化

在本實驗中，與對照組相比，PI3K抑制劑組和DESI2空載+PI3K抑制劑組細胞活性明顯下降，G1期比例升高，S期和G2期比例降低，凋亡明顯升高，細胞侵襲能力明顯下降，DESI2和Caspase3的表達明顯升高，AKT、PI3K和mTOR及其磷酸化的表達量明顯下降。與PI3K抑制劑組相比，DESI2干擾+PI3K抑制劑組細胞活性明顯升高，G1期比例降低，S期比例升高，凋亡明顯下降，細胞侵襲能力明顯升高，DESI2和Caspase3的表達明顯下降，AKT、PI3K和mTOR及其磷酸化的表達量明顯升高。這表明PI3K/AKT/mTOR信號通路的功能狀態能反饋調節上游DESI2基因的表達。得到這一結論的可能原因有以下幾個方面：第一，單獨的PI3K抑制劑可以明顯達到抗腫瘤的效果，但是聯合DESI2干擾后這一效果明顯受到影響；第二，DESI2基因與PI3K/AKT/mTOR通路可以同時影響Caspase3蛋白的生成，因此兩者之間可能有共同的凋亡途徑，加入DESI2干擾后明顯影響了腫瘤細胞的凋亡過程；第三，通過體外生物學實驗表明，通過PI3K抑制劑處理后ASPC-1細胞的生存能力明顯降低、侵襲能力明顯減弱以及凋亡明顯增加，但是加入DESI2干擾后這些效果明顯受到影響；第四，通過蛋白表達水平檢測發現，加入DESI2干擾后AKT、PI3K和mTOR及其磷酸化的表達量明顯升高，而這些蛋白表達量的改變將進一步影響腫瘤細胞的凋亡過程。

總之，胰腺癌的細胞凋亡過程與AKT/mTOR及DESI2蛋白的表達密切相關，抑制DESI2蛋白的表達可能激活AKT/mTOR信號通路，促進腫瘤細胞的生長和浸潤。因此本課題組下一步將繼續對聯合使用DESI2過表達載體與PI3K抑制劑進行研究，希望能為進一步提高胰腺腫瘤的治療效果提供新的思路。

圖6 各組細胞侵襲結果

圖7 各組細胞中的DESI2、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、p-mTOR、mTOR、Caspase3表達結果