不同產地姜黃藥材高效液相色譜指紋圖譜與化學模式識別研究*

黃衛娟，韋卓純，姜 松，林 繪，楊麗玲

（暨南大學醫學院附屬東莞醫院藥學部，廣東 東莞 523900）

姜黃為姜科姜黃屬多年生草本植物，具有破血行氣、通經止痛的功效，臨床用于治療胸痹心痛、痛經經閉、跌撲腫痛等[1]。姜黃主要成分是姜黃素類化合物，包括姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素等成分，具有抗癌[2-4]、抗炎[5]、抗氧化[6]、抗動脈粥樣硬化[7-8]和保護中樞神經系統[9-11]等多種藥理活性，已被廣泛用于食品添加劑（無毒天然色素[12]）、化妝品（抗氧化、抗衰老）和醫藥（抗癌、抗抑郁[13-15]）等領域。姜黃和片姜黃均為姜科植物，前者源于姜黃干燥根莖，性溫，祛瘀力強，常用于治療寒凝氣滯血瘀之證；后者源于溫郁金干燥根莖，性寒，行氣力強，以治療血熱瘀滯之證效佳[16]。但因兩者名稱相似，來源相近，藥典收載的功能主治相同[1]，臨床使用中時常混淆，加之市場上流通的姜黃藥材品種混亂，質量差異較大，直接影響姜黃的藥效。中藥指紋圖譜能全面反映中藥的質量與臨床療效，常被用于控制中藥的質量及區分易混淆的中藥材[17]。而聚類分析（HCA）和主成分分析（PCA）常被用于色譜指紋圖譜的數據處理[17]，進而比較各藥材樣品的質量差異。本研究中基于高效液相色譜（HPLC）技術，應用化學模式識別技術中的HCA和PCA技術研究市售姜黃藥材的質量差異，為姜黃藥材的質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

C-15C型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；BT25S型電子分析天平（德國 Sartorius公司）；BY-320C型低速醫用離心機（北京白洋醫療器械有限公司）；KQ-300型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

姜黃素對照品（批號為DST170111-014，純度≥99%），去甲氧基姜黃素對照品（批號為DST160920-30，純度≥98%），雙去甲氧基姜黃素對照品（批號為DST160920-21，純度≥98%），均購自成都德思特生物技術有限公司；乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；無水乙醇（分析純，廣州市中南化學試劑有限公司）；水為超純水。10批姜黃藥材（具體信息見表1）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu ODS-C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -0.2% 甲酸溶液，梯度洗脫（見表 2）；檢測波長：254 nm；柱溫：35℃；流速：1.0 mL ／min；進樣量：10 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：稱取姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素各2.5 mg，精密稱定，分別置25 mL具塞錐形瓶中，加甲醇溶解并定容，得質量濃度均為100 μg／mL 的單一對照品溶液；分別精密量取 2.5 mL，置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得。

供試品溶液：取藥材樣品適量，粉碎，過5號篩，稱取0.2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇20 mL，超聲提取（功率300 W，頻率40 kHz）20 min，冷卻，搖勻，5 000 r／min 離心 10 min，取上清液，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

空白對照溶液：以流動相作為空白對照溶液。

2.3 方法學考察

精密度試驗：依法制備供試品（批號為20160801）溶液，按擬訂色譜條件，連續進樣6次，測定，以姜黃素峰（5號峰）為參照峰，分別測得其中11個色譜峰的相對峰面積和相對保留時間，并計算RSD。結果11個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.03%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.00%（n=6），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：依法制備供試品（批號為20160801）溶液，按擬訂色譜條件，室溫下分別于 0，2，6，8，12，24，48 h時進樣測定，以姜黃素（5號峰）為參照峰，分別測得其中11個色譜峰的相對峰面積和相對保留時間，并計算RSD。結果11個共有峰相對保留時間的RSD均小于 0.10% （n=7），相對峰面積的RSD均小于2.64%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內穩定。

重復性試驗：稱取同一姜黃藥材樣品（批號為20160801）6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，以姜黃素峰（5號峰）為參照峰，分別測得其中11個色譜峰的相對峰面積和相對保留時間，并計算RSD。結果11個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.20% （n=6），相對峰面積的RSD均小于 2.00% （n=6），表明方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與分析

共有模式的建立及共有峰確定：取10批藥材樣品各適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。通過“中藥指紋圖譜相似度評價系統（2012 A版）”軟件生成對照指紋圖譜色譜圖，并對10批姜黃樣品的色譜指紋峰進行匹配并疊加（見圖2），得11個共有峰（見圖3）。可見，10批藥材樣品的指紋圖譜無明顯差異，均可用于共有峰的確定。

相似度評價：采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統（2004 A版）”對藥材樣品指紋圖譜進行相似度評價，結果對照指紋圖譜的相似度均不小于0.919，見表3，表明不同批次藥材間相似度良好。

聚類分析：采用SPSS 19.0統計學軟件對圖3中11個共有峰的相對峰面積進行系統聚類，采用組間聯接的聚類方法，以歐氏距離為區間進行聚類分析，生成聚類樹狀圖（見圖4），10批藥材樣品大致可分為3類，S2，S3，S6，S8，S1，S9，S4，S7 為第一類；S5 為第二類；S10為第三類，可見，S5，S10與其余8批次藥材樣品比較有明顯差異。

圖2 10批藥材樣品的HPLC疊加指紋圖譜

圖3 10批藥材樣品HPLC對照指紋圖譜

表3 10批藥材樣品的相似度評價

圖4 聚類分析樹狀圖

主成分分析：采用SPSS 19.0統計學軟件，以10批藥材樣品中11個共有峰面積原始值為變量，計算主成分特征值、累積貢獻率及主成分得分。由主成分特征值和累積貢獻率（表4）、碎石圖（圖5）得知，前4個特征值的累積貢獻率達92.902%，說明前4個因子在反映不同來源姜黃與11個共有成分的相互關系中起主導作用，能用于評價姜黃藥材的品質。其中，主成分1主要反映了 3，4，5，8，9號色譜峰的信息，主成分 2主要反映了1，2，10，11號色譜峰的信息，主成分3主要反映了7號色譜峰的信息，主成分4主要反映了6號色譜峰的信息（見表5）。結果表明，通過PCA分析降維處理后所提取的4個主成分能代表姜黃指紋圖譜中11個共有峰的主要信息。以主成分的變量得到的載荷圖（圖6）結果與初始因子載荷矩陣表相同，距離原點較遠的幾個點就是主成分1中權重較大的成分，表明其在決定不同批次樣品質量差異上起重要作用。

表4 主成分特征值和累積貢獻率

圖5 碎石圖

3 討論

預試驗中比較了水、無水乙醇、40%乙醇、75%乙醇、甲醇、30%甲醇、60%甲醇7種提取溶劑，加熱回流、超聲 2 種提取方法，10，20，30，60 min 4 種提取時間及10，20，40，50 mL 4種提取溶劑體積等制備方法，結果以20 mL 75%乙醇超聲提取20 min時所得提取率最佳。

比較了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液5種流動相及13個梯度洗脫條件，結果以乙腈-0.2%甲酸溶液為流動相時，梯度洗脫獲得色譜峰多且分離度好。考察了254 nm和265 nm 2個檢測波長，結果顯示，在254 nm波長處各色譜峰峰形好且峰面積較大，故選定為檢測波長。比較了30，35，40℃ 3種柱溫，結果柱溫為35℃時獲得的各色譜峰峰面積、拖尾因子、分離度均較好。分別以 0.8，1.0 mL ／min 為流速進行比較，結果1.0 mL／min流速下峰面積較大且出峰時間合適。

表5 初始因子載荷矩陣

圖6 10批藥材樣品的載荷圖

10批藥材樣品與對照指紋圖譜的相似度為0.919～0.999，說明不同產地姜黃藥材間相似度較好。這也提示了單一的相似度評價難以全面地反映不同產地姜黃藥材的差異性。為了更全面、整體地評價各個產地姜黃的質量差異，采用化學模式識別方法中的HCA和PCA進一步分析，建立藥材樣品的HCA和PCA分類模型，發現批次S5和S10與其余8批次比較有明顯差異，并確定了4個主成分，篩選出5個差異性成分，指認出了其中3個成分，分別為姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素。

綜上所述，本研究中建立的姜黃HPLC指紋圖譜較理想，結合化學模式識別技術可用于姜黃藥材的質量控制，為中藥材的識別和化學成分的比較提供了參考，亦為課題組后續關于單味中藥姜黃對斑馬魚內毒素性炎癥損傷保護作用及作用機制的研究提供了試驗用藥材、試驗用制劑質量控制的依據。