基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-3對(duì)喉癌細(xì)胞順鉑化療敏感性提高的機(jī)制研究

郜元坤，張志敏，秦 靜，余滋中，李國義

（湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻喉科，湖北 十堰 442000）

對(duì)于喉癌早期，手術(shù)治療是最有效的方法，但大多數(shù)患者初診時(shí)已為晚期，癌細(xì)胞已廣泛轉(zhuǎn)移，手術(shù)效果差。晚期治療手段通常包括化學(xué)治療（簡稱化療）、放射治療（簡稱放療）及輔助治療，但由于化療耐藥性的發(fā)展，喉癌總生存率無提高。故評(píng)估化療藥物的分子抗性對(duì)于提高喉癌的療效極為重要[1]。基質(zhì)金屬蛋白酶對(duì)喉癌的轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，且基質(zhì)金屬蛋白酶高表達(dá)與喉癌預(yù)后不良有關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）能明顯抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性[2]。TIMP-3不僅能抑制金屬蛋白酶的活性，而且不受其他TIMP調(diào)節(jié)成員的影響。TIMP-3可延緩癌癥的進(jìn)展，如腫瘤生長，血管生成和侵襲等，可在幾種癌癥（肝癌、肺癌、胰腺癌等）中觀察到TIMP-3的異常表達(dá)[3-5]。本研究中探討了TIMP-3通過線粒體依賴性細(xì)胞凋亡途徑對(duì)喉癌細(xì)胞順鉑化療敏感性的影響，以便為喉癌的治療提供理論及臨床依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、儀器與試藥

細(xì)胞：人喉癌細(xì)胞系Hep-2由美國菌種保藏中心（ATCC）提供。

儀器：T100型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）；NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測儀、MK3型酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；FV1000型熒光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；SIGMA 500型高分辨率場發(fā)射掃描電鏡（德國Zeiss公司）。

試藥：順鉑（批號(hào)為 AW48794，含量為 99.99%）；5，5′，6，6′-四氯 -1，1′，3，3′-四乙基 -苯并 - 咪唑并喹啉碘化物（JC-1）；噻唑藍(lán)（MTT），均購自美國 Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司）；胰酶（德國Merck公司）；TIMP-3 mimics（上海伯豪生物技術(shù)有限公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（日本 Takara公司），細(xì)胞色素酶 C、胱天蛋白酶 -3（Caspase-3）、胱天蛋白酶 -9（Caspase-9）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海伯豪生物技術(shù)有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 方法

Hep-2細(xì)胞株 TIMP-3 mimics轉(zhuǎn)染：取 10 mL Hep-2細(xì)胞液接種于 6孔板上，取TIMP-3 mimics 100 pmol，置 200 μL DMEM 培養(yǎng)基中，取 4 μL 脂質(zhì)體2000，置200 μL DMEM培養(yǎng)基中，混勻脂質(zhì)體2000和miRNA液，室溫培育30 min，無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，將混合液加入細(xì)胞孔內(nèi)，6 h后棄混合液，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染情況。

分組與藥物劑量設(shè)計(jì)：試驗(yàn)分為空白對(duì)照組（A 組）、順鉑組（B 組）和順鉑 +TIMP-3組（C 組），A 組和B組均為10 mL Hep-2細(xì)胞液溶于10%胎牛血清中，分別加入 0和 5 μmol／L順鉑 5 mL，置 CO2培養(yǎng)箱中，于37 ℃、5%CO2、20%O2條件下培養(yǎng) 72 h；C 組為 10 mL轉(zhuǎn)染 TIMP-3 的 Hep-2 細(xì)胞液加入順鉑（5 μmol／L）5 mL，置 CO2培養(yǎng)箱中，于 37 ℃、5%CO2、20%O2條件下培養(yǎng)72 h；各組每孔設(shè)6個(gè)平行樣。

Hep-2細(xì)胞活力及細(xì)胞單克隆形成數(shù)目：每孔加入 MTT 溶液（5 mg／mL）10 μL，37 ℃恒溫箱孵育 4 h，加入150 μL的DMSO，采用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定吸光度（OD）值，以O(shè)D值代表細(xì)胞活力，并計(jì)算細(xì)胞存活率[（試驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）／（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%]；在含有DMEM的10%胎牛血清中的12孔板（每孔1×103個(gè)）中培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)5 d后，用亞甲藍(lán)染色細(xì)胞確定5個(gè)成像區(qū)域中的菌落形成數(shù)目。

Hep-2細(xì)胞凋亡：Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，通過胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。將細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白Ⅴ-FITC和PI溶液在黑暗中染色15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

線粒體凋亡：Hep-2細(xì)胞與JC-1工作溶液在暗室中于37℃條件下溫育15 min，PBS洗滌2次后，使用熒光共聚焦顯微鏡測定紅／綠熒光強(qiáng)度。JC-1在活細(xì)胞中表現(xiàn)為線粒體潛在的依賴性積累，用紅色熒光表示；在凋亡細(xì)胞中，染料流出到細(xì)胞質(zhì)中作為單體并發(fā)出綠色熒光，其中線粒體膜電位（MMP）被打破，故紅／綠熒光強(qiáng)度比可表示線粒體MMP的變化情況。

Hep-2細(xì)胞液中TIMP-3 mRNA表達(dá)水平：取各組細(xì)胞液，Trizol法提取RNA，鑒定完RNA純度和完整性后，反轉(zhuǎn)錄制備 cDNA。PCR反應(yīng)體系：正向引物10 μL、反向引物 10 μL、RNA 模版 0.6 μL、超級(jí)酶混合物 0.2 μL、2 × μByr一步法 RT-qPCR 緩沖液 5 μL、去RNA 水 3.4 μL。PCR 條件：95 ℃變性 10 min，循環(huán)40 次，60 ℃退火 15 s。通過 2-ΔΔCt方法計(jì)算 miR-452相對(duì)表達(dá)水平。使用內(nèi)源性U6小核RNA（U6）上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；TIMP-3 上游引物：5′-AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC-3′，下游引物：5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3′。

Hep-2細(xì)胞液中細(xì)胞色素酶 C、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平：取各組細(xì)胞液，5 000 r／min離心，收集細(xì)胞，加PBS制成細(xì)胞懸液后，ELISA法測定細(xì)胞色素酶C、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Hep-2細(xì)胞活力和細(xì)胞單克隆形成數(shù)目

與A組比較，B組和C組細(xì)胞活力、存活率水平、細(xì)胞單克隆形成數(shù)目均顯著降低（P＜0.01）；與B組比較，C組細(xì)胞活力、存活率水平、細(xì)胞單克隆形成數(shù)目場顯著降低（P＜0.01）。詳見表 1和圖 1。

表1 3組Hep-2細(xì)胞活力和單克隆形成數(shù)目比較（±s，n=6）

表1 3組Hep-2細(xì)胞活力和單克隆形成數(shù)目比較（±s，n=6）

注：與 A 組比較，aP ＜0.01；與 B 組比較，bP ＜0.01。表 2和表3同。

組別A組B組C組OD值0.82 ± 0.05 0.54 ± 0.02a 0.22 ± 0.05ab存活率（%）78.52 ± 8.25 42.01 ±8.24a 24.36 ± 3.21ab單克隆形成數(shù)目175.32 ±10.25 88.25 ±9.58a 34.12 ±8.32ab

圖1 3組Hep-2細(xì)胞單克隆形成數(shù)目

2.2 Hep-2細(xì)胞凋亡率

與A組比較，B組和C組細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.01）；與 B組比較，C組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）。詳見表 2和圖 2。

表2 3組Hep-2細(xì)胞凋亡率、MMP及TIMP-3 mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=6）

表2 3組Hep-2細(xì)胞凋亡率、MMP及TIMP-3 mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=6）

組別A組B組C組凋亡率（%）4.70 ± 2.54 14.30 ± 2.87a 16.80 ± 2.12ab紅／綠熒光比值1.23 ±0.12 0.74 ±0.22a 0.42 ±0.15ab TIMP-3 mRNA 0.91 ± 0.17 1.45 ± 0.29a 3.67 ± 0.23ab

圖2 3組Hep-2細(xì)胞凋亡情況

2.3 Hep-2細(xì)胞 MMP

與A組比較，B組和C組細(xì)胞MMP均顯著降低（P＜0.01）；與 B組比較，C組細(xì)胞 MMP顯著降低（P＜0.01）。詳見表 2和圖 3。

圖3 3組Hep-2細(xì)胞MMP情況

2.4 Hep-2細(xì)胞TIMP-3 mRNA表達(dá)

與A組比較，B組和C組細(xì)胞TIMP-3 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與 B組比較，C組細(xì)胞TIMP-3 mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。詳見表2。

2.5 細(xì)胞色素酶C、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)

與A組比較，B組和C組細(xì)胞色素酶C、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與B組比較，C組細(xì)胞色素酶C、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。詳見表 3。

表3 3組細(xì)胞色素酶C、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)水平比較（±s，n=6）

表3 3組細(xì)胞色素酶C、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)水平比較（±s，n=6）

組別A組B組C組細(xì)胞色素酶C 78.52 ± 16.32 252.01 ± 29.32a 496.21 ± 33.21ab Caspase-3 89.63 ±19.36 265.32 ±36.54a 564.32 ±26.36ab Caspase-9 54.32 ±26.32 396.23 ±49.32a 895.23 ±46.39ab

2.6 各變量的相關(guān)性分析

TIMP-3與細(xì)胞色素酶 C、Caspase-3、Caspase-9呈顯著正相關(guān)（P＜0.01）。詳見表 4。

表4 各變量的相關(guān)性分析

3 討論

雖然喉癌的診斷和治療水平已逐漸提高，但其死亡率仍然很高，其5年總體死亡率達(dá)40%[6]。晚期化療耐藥和晚期轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致喉癌預(yù)后不良的原因。本研究結(jié)果顯示，TIMP-3提高喉癌細(xì)胞順鉑化療敏感性與線粒體膜電位穩(wěn)定有關(guān)；TIMP-3的上調(diào)MMP去極化和線粒體細(xì)胞色素C釋放，提高了順鉑化療敏感性。

TIMP-3是TIMP基因家族成員[7]，可抑制腫瘤細(xì)胞繁殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制淋巴管生成和血管生成，以及癌癥對(duì)抗癌藥物的干擾反應(yīng)。TIMP-3低水平表達(dá)與不同癌癥的進(jìn)展相關(guān)[8-9]，在宮頸癌及軟骨肉瘤中TIMP-3 mRNA表達(dá)水平降低，在喉鱗狀細(xì)胞癌中TIMP-3表達(dá)降低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。上述研究結(jié)果提示，TIMP-3在腫瘤進(jìn)展中具有關(guān)鍵調(diào)控作用。

金屬基質(zhì)酶的失調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)周轉(zhuǎn)增加，這是許多腫瘤局部侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[11-12]。TIMP能降低MMP，表明其在癌癥生物療法中有獨(dú)特作用。TIMP-1和TIMP-2可抑制癌細(xì)胞侵襲，TIMP-3可抑制癌細(xì)胞侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具有用于癌癥基因治療的優(yōu)勢[13]。此外，TIMP-3對(duì)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有“旁觀者效應(yīng)”。過度表達(dá)的TIMP-3可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，上調(diào)p53，F(xiàn)as配體，TNFR1和TNFR2的表達(dá)。研究表明，TIMP-3通過Caspase誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，TIMP-3的過度表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放并激活Caspase-8和Caspase-9，兩者均可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。TIMP-3還可通過Fas相關(guān)死亡域誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。研究結(jié)果顯示，TIMP-3能在人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中缺乏Caspase-8活化時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明TIMP-3可通過除死亡受體信號(hào)傳導(dǎo)外的其他途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。

綜上所述，TIMP-3能提高喉癌Hep-2細(xì)胞順鉑化療敏感性，其機(jī)制與上調(diào)TIMP-3，促進(jìn)MMP去極化和線粒體細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)Caspase-3和Caspase-9過表達(dá)引起細(xì)胞凋亡有關(guān)。