高效液相色譜法測定肝精補(bǔ)血素口服液中黨參炔苷含量

張 憲，李 岳

（北京市藥品檢驗所·中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206）

肝精補(bǔ)血素口服液由黨參、枸杞子、肝精膏、枸櫞酸鐵銨、維生素B1等組方，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收錄于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第十三冊）》中，臨床主要用于缺鐵性貧血的治療，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的作用[1-2]。方中黨參為君藥，具有補(bǔ)益脾胃、養(yǎng)血生津的作用[3]。但原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較簡單，未對其進(jìn)行質(zhì)量控制。黨參的主要藥效活性成分為黨參炔苷和黨參多糖[4-6]，本研究中參考藥典黨參藥材鑒別項下黨參炔苷的鑒別[7-8]和相關(guān)報道[9-11]，建立高效液相色譜（HPLC）法測定肝精補(bǔ)血素口服液中黨參炔苷的含量，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂和改進(jìn)提供試驗依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀，包括全自動進(jìn)樣器，Agilent Chemstation工作站（美國Agilent公司）；ME403型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

肝精補(bǔ)血素口服液（開封康諾藥業(yè)有限公司，批號分別為 H17012，H18031，H18061，規(guī)格為每支 10 mL）；黨參炔苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111732-201107，含量≥98% ）；大孔樹脂 D101（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，批號為30266071）；乙腈為色譜純，甲醇、醋酸、磷酸、乙醇、正丁醇均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -0.4%醋酸（22∶78，V／V）；流速：1.0mL ／min；檢測波長：267 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

對照品溶液：稱取對照品9.43 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為對照品貯備溶液；精密吸取1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得對照品溶液（每1 mL含黨參炔苷37.72 μg）。

供試品溶液：精密量取樣品20 mL，置分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，過大孔樹脂柱（高12 cm，內(nèi)徑1.5 cm），用水50 mL洗脫，棄去水液，用30%乙醇50mL洗脫，棄去30%乙醇洗脫液，再用50%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至5 mL，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按樣品處方工藝制備缺黨參藥材的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制備，即得。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。理論板數(shù)按黨參炔苷峰計應(yīng)不低于8 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。

線性關(guān)系考察：分別精密量取對照品溶液1，2，5，10，15 μL。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以黨參炔苷進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1.586 3X+6.925 3，r=0.999 5（n=5）。結(jié)果表明，黨參炔苷進(jìn)樣量在 37.72 ～565.80 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取對照品貯備液適量，按擬訂色譜條件以不同進(jìn)樣體積連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果進(jìn)樣 1 μL 時的RSD為 3.12% （n=6），進(jìn)樣 5 μL 時的RSD為 1.35% （n=6），進(jìn)樣 15 μL 時的RSD為0.83%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液（批號為H18031）適量，分別于室溫下放置 0，1，2，4，8，12，24 h 時按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為1.24%（n=7），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：稱取樣品（批號為H18031）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果的RSD為1.05%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量樣品（批號為H18031）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的黨參炔苷對照品溶液，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 黨參炔苷加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品各適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，平行3次，記錄峰面積，計算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品中黨參炔苷含量測定結(jié)果（g／L，n=3）

3 討論

3.1 供試品制備方法選擇

預(yù)試驗中采用3種方法制備供試品溶液：1）精密量取樣品20mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣加甲醇25mL，超聲30 min，濾過，精密吸取濾液3 mL，加甲醇定容至25 mL，搖勻，經(jīng) 0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。2）精密量取樣品20 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，過大孔樹脂柱，用水50 mL洗脫后，再用30%乙醇50 mL洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用50%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液蒸干，殘渣用甲醇定容至5 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。3）精密量取樣品20 mL，置分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次30 mL正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，過大孔樹脂柱，用水50 mL洗脫后，再用30%乙醇50 mL洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用50%乙醇100mL洗脫，收集洗脫液蒸干，用甲醇溶解并定容至5mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第3種方法適用于本試驗中的含量測定，因黨參炔苷屬皂苷類化合物，需要采用正丁醇提取才可提取完全，直接超聲方法雖可測得，但黨參炔苷峰面積較小，而直接過大孔樹脂柱，黨參炔苷無色譜峰出現(xiàn)。

3.2 流動相和檢測波長選擇

預(yù)試驗中分別采用乙腈-水，乙腈-0.4%醋酸，甲醇-0.5%磷酸溶液作為流動相進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.4%醋酸為流動相時色譜圖基線平穩(wěn)，峰形較好、干擾小、無拖尾現(xiàn)象，最后確定乙腈-0.4%醋酸作為本試驗的流動相系統(tǒng)。同時對乙腈-0.4%醋酸的不同比例（26 ∶74，23 ∶77，22∶78）進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著乙腈比例的增大，保留時間逐漸縮短，色譜圖峰形干擾大，因此確定比例為22∶78，保留時間在8.8 min左右較合適。試驗中采用二極管陣列檢測器對黨參炔苷對照品進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果在242，253，267，283 nm波長處均有最大吸收，通過比較供試品溶液黨參炔苷的峰形發(fā)現(xiàn)，在267 nm波長處色譜圖峰形較好，理論板數(shù)和對稱因子符合要求。

綜上所述，本研究中建立的HPLC法操作簡便、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均良好，可用于測定肝精補(bǔ)血素口服液中黨參炔苷的含量。