電針調控SIRT1/FoxO1對肥胖大鼠胰島素敏感性及脂聯素的影響?

楊亞南，舒 晴，陳 麗，周煥嬌，梁鳳霞△

(1.華潤武鋼總醫院中醫科，武漢 430081； 2. 武漢大學中南醫院康復醫學科，武漢 430071； 3. 湖北中醫藥大學針灸骨傷學院，武漢 430061)

胰島素抵抗(insulin resistance, IR)是指胰島素的效應器官(如肝臟、骨骼肌、脂肪組織、血管內皮細胞及動脈平滑肌細胞等)對正常劑量的胰島素產生低于正常生物學效應的一種病理生理狀態[1]。胰島素抵抗在男性和女性肥胖人群中的發生率分別約為64.9%和73.2%[2]，且在腹型肥胖人群中的發病率較高[3]，因此肥胖是發生2型糖尿病和胰島素抵抗的重要危險因素之一[4]。脂聯素(Adiponectin)是白色脂肪組織分泌的一種重要脂肪因子，具有促進脂肪酸氧化、抑制糖異生、增加胰島素敏感性、抑制慢性炎癥的作用，是與胰島素抵抗關系最緊密的一個特異性因子。大量研究顯示，肥胖個體脂肪組織分泌的脂聯素減少，而血清脂聯素水平與胰島素抵抗指數呈顯著負相關[5-6]。脂聯素的基因表達受到多種轉錄因子的調控，叉頭狀轉錄因子1(forkhead box transcription factor 1, FoxO1)作為調節能量代謝的重要轉錄因子之一，參與脂聯素基因轉錄水平的調控，而該復合物的激活則依賴于去乙酰化酶沉默信息調節因子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1, SIRT1)的活性[7]。中醫針灸作為一種綠色治療方案，已越來越多地在臨床上應用于肥胖和胰島素抵抗的治療。前期研究顯示，電針能夠通過調控下丘腦中SIRT1/FoxO1信號通路，發揮抑制食欲、改善肥胖和胰島素抵抗的作用[8]。本實驗以脂聯素的基因調控為切入點，觀察電針通過調控白色脂肪組織SIRT1/FoxO1發揮改善肥胖胰島素抵抗的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物造模與分組

40只SPF級Wistar雄性大鼠均由湖北省實驗動物中心提供(許可證號42000600013006)，適應性喂養1周。其中10只大鼠給予普通飼料總熱能(3.8kcal/g，含70%碳水化合物，20%蛋白質，10%脂肪)喂養8周，直接納入正常組。另外30只大鼠給予高脂飼料(5.4kcal/g，38.5% 碳水化合物, 15% 蛋白質, 46.5% 脂肪)喂養8周[9]。以高脂喂養大鼠體質量高于普通飼料喂養大鼠體質量平均值的20%以上作為肥胖標準[10]。最終有26只大鼠符合肥胖模型標準，隨機挑選20只分為模型組和電針組各10只。大鼠喂養及干預期間自由進食飲水，12 h明暗周期，動物房溫度(22±2) ℃，相對溫度(50±10)%。每天更換墊料、飲水、清洗大鼠飲水器。動物處理及飼養條件遵照動物福利的相關規定及《中華人民共和國實驗動物管理條例》和《實驗動物質量管理辦法》實施。

1.2 主要試劑與儀器

脂聯素ELISA檢測試劑盒(南京建成)；胰島素檢測試劑盒(Elabscience)；脂肪組織蛋白提取試劑盒(百奧萊博)；SDS凝膠配制試劑盒(碧云天)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)；Anti-SIRT1抗體(ab110304, Abcam)；Anti-FoxO1抗體(ab52857, Abcam)；Anti- Adiponectin抗體(ab22554，Abcam)；RNA提取試劑盒(Takara)；RNA逆轉錄試劑盒(TOYOBO)；SYBR? Green Realtime-PCR Master Mix(TOYOBO)。

一次性無菌針灸針(0.30×20 mm，蘇州環球)；韓氏電針儀(HANS LH202H)；快速血糖儀(美國強生)；酶標儀(BIO-RAD)；Western電泳儀(BIO-RAD)；半干轉膜儀(BIO-RAD)；凝膠掃描成像系統(BIO-RAD)；核酸測定儀(德國IMPLEN)；普通PCR儀(西安天隆)；實時熒光定量PCR儀(BIO-RAD)。

1.3 干預方法

電針治療取穴豐隆、中脘、關元、足三里。穴位定位、針刺方向、深度參考2003年1月出版的《實驗動物學》及相關權威文獻[11]。采用0.3×25 mm不銹鋼毫針，進針后針柄連接HANS LH202H型電針治療儀，參數設定為頻率2 Hz，強度1 mA，連續波。同側足三里和豐隆穴連接同一輸出的2個電極，關元和中脘連接另一輸出的2個電極，足三里和豐隆左右兩側交替使用。每日電針10 min，每周治療3次，連續治療8周。以上采取的電針參數均參考相關文獻并進行前期預試驗后決定[12]。

電針組大鼠在造模成功后繼續采用高脂飼料喂養8周，同時接受電針治療；正常組大鼠在普通飼料喂養8周后繼續采用普通飼料喂養8周；模型組大鼠在造模成功后繼續采用高脂飼料喂養8周，正常組和模型組大鼠在電針組進行治療期間采用同樣的方法進行抓取和固定。

1.4 指標檢測

1.4.1 體質量、血糖、血清胰島素、血清脂聯素 用電子天平在治療前后分別測量所有大鼠的體質量；用快速血糖儀在治療前后分別采用尾尖取血的方式采集大鼠撤食12 h后空腹血糖及大鼠未撤食狀態下上午8AM的餐后血糖。處死大鼠前用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，采用心尖采血方法獲取血清樣本，嚴格按照試劑盒使用說明書操作，采用ELISA法檢測大鼠血清中的胰島素和脂聯素水平。

1.4.2 腹腔糖耐量(IPGTT)、腹腔胰島素耐量(IPITT) 在治療7周后測量IPGTT：大鼠空腹12 h注射前測空腹血糖(0 min)，隨后根據大鼠體質量腹腔注射相應體積的50%葡萄糖(2 g/kg)，分別在注射后30、60、90、120 min尾尖取血測血糖。IPITT：大鼠空腹8 h，注射前測空腹血糖(0 min)，隨后根據體質量腹腔注射相應體積的胰島素生理鹽水稀釋液(0.5U/ml)，給藥劑量為1U/kg，分別在注射后30、60、90、120 min尾尖取血測血糖。采用近似梯形法計算曲線下面積(area under the curve, AUC)[13]。AUC (min · mg/dL)=30 min × [1/2 × (BG0 + BG120) + 1 × (BG30 + BG60 + BG90)]。

1.4.3 脂肪組織SIRT1、FoxO1、Adiponectin的蛋白表達水平 采用Western blotting(WB)法檢測白色脂肪組織中的SIRT1、FoxO1、Adiponectin蛋白含量。具體方法：大鼠麻醉后快速斷頭處死，取新鮮白色脂肪組織放入液氮中速凍，再轉至-80 ℃冰箱中保存備用。提取脂肪蛋白BCA法進行蛋白濃度檢測，8%～10% SDS凝膠電泳中進行蛋白分離，半干轉膜法轉膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗4°過夜。第2天二抗孵育1 h，洗膜后在顯影儀中成像。各組大鼠隨機挑選3只進行WB蛋白定量。以目的蛋白條帶的光密度值(IOD)與β-Actin的比值作為蛋白的相對表達量。

1.4.4 脂肪組織SIRT1、FoxO1、Adiponectin的基因表達水平 采用實時熒光定量PCR法檢測脂肪組織SIRT1、FoxO1、Adiponectin的mRNA水平。取100 mg新鮮白色脂肪組織提取脂肪總RNA，每組取2 μL進行核酸濃度檢測，以RNA純度(OD260/OD280)在1.9～2.2為可用，濃度以0.1～0.9 μg/μL為宜。配制逆轉錄體系獲取cDNA，保存于-20 ℃。配制熒光定量擴增體系，每個樣本3個副孔，以β-Actin作為對照，檢測目的基因SIRT1、FoxO1、Adiponectin的相對表達水平，引物自主設計、生物公司合成，序列如下。

表1 PCR引物序列

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠干預前后體質量、血糖、胰島素敏感性比較

圖1顯示，在治療前肥胖模型大鼠體質量顯著高于正常組(P<0.01),電針組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療8周后，各組大鼠的體質量均較治療前上升(P<0.01)，模型組大鼠體質量的上升幅度顯著高于電針組(P<0.01)。圖1顯示，各組大鼠治療前后的空腹血糖比較差異無統計學意義(P>0.05)，且在正常范圍內；治療前各組大鼠的餐后血糖亦在正常范圍內，但電針組的餐后血糖顯著低于模型組(P<0.05)，與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1顯示，腹腔注射50%葡萄糖后，各組大鼠的的血糖迅速升高。注射后30 min后，模型組大鼠的血糖值顯著高于正常組和電針組(P<0.05)，正常組與電針組血糖比較差異無統計學意義(P>0.05)；注射60～120 min后，各組血糖未見明顯差異(P>0.05)。計算各組血糖AUC，正常組AUC低于模型組(P<0.01)，與電針組比較差異無統計學意義(P>0.05)，電針組AUC低于模型組(P<0.05)。腹腔注射胰島素后，各組大鼠的血糖在60 min內出現下降，隨后血糖值上升，模型組血糖水平下降幅度低于正常組和電針組(P<0.05)；注射胰島素120 min后，模型組血糖回升至注射前水平，正常組和模型組仍保持在較低的血糖水平,且與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。計算3組血糖AUC，模型組顯著高于正常組和電針組(P<0.05)，正常組與電針組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠血清胰島素、脂聯素水平比較

如圖1D所示，與正常組比較，模型組和電針組的大鼠血清胰島素水平顯著升高(P<0.01)，而脂聯素水平出現明顯下降(P<0.01)，說明肥胖大鼠的脂聯素水平與胰島素水平呈一定的負相關；與模型組比較，電針干預后大鼠的血清胰島素水平出現明顯下降(P<0.01)，脂聯素水平明顯上升(P<0.01)。

2.3 各組大鼠白色脂肪組織SIRT1、FoxO1、Adiponectin的蛋白表達水平比較

圖1E/F顯示，各組大鼠白色脂肪組織SIRT1、FoxO1、Adiponectin的蛋白電泳條帶。普通飼料喂養的大鼠白色脂肪組織中的SIRT1蛋白表達水平顯著高于模型組和電針組中的肥胖大鼠(P<0.01)，而電針治療后SIRT1的蛋白表達水平顯著高于模型組(P<0.01)；正常組大鼠白色脂肪組織中的FoxO1蛋白表達顯著高于肥胖大鼠(P<0.01)，電針組蛋白表達量平均值雖高于模型組，但差異無統計學意義(P>0.05)，可能與樣本量有關；正常組大鼠白色脂肪組織中的脂聯素蛋白表達高于模型組和電針組(P<0.01)，電針組高于模型組(P<0.01)。

2.4 各組大鼠白色脂肪組織SIRT1、FoxO1、Adiponectin的基因表達水平比較

圖1G顯示，各組大鼠白色脂肪組織中SIRT1、FoxO1、Adiponectin的相對mRNA水平。正常組大鼠的SIRT1、FoxO1的基因表達水平顯著高于模型組和電針組(P<0.01)，模型組與電針組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。與正常組比較，模型組和電針組脂聯素基因表達水平出現下調(P<0.01)；與模型組比較，電針組的基因表達水平出現上調(P<0.01)。

3 討論

肥胖時脂肪組織會產生過多的非酯化脂肪酸、脂肪因子(瘦素、脂聯素、抵抗素等)、促炎癥因子，其通過促進慢性炎癥、上調氧化應激等多個途徑介導胰島素抵抗的發生，是胰島素抵抗發病機制中的關鍵因素[14]。因此，在肥胖的早期進行干預對于改善胰島素抵抗，并預防其發展為2型糖尿病具有重要意義。近年來，針灸越來越廣泛地被用于肥胖等胰島素抵抗相關性疾病的防治中。系統評價顯示，針灸治療肥胖病安全有效，不僅可以調節肥胖患者的脂質代謝，還能夠改善肥胖患者的胰島素抵抗狀態[15]。國內外學者展開了較深入的針灸治療肥胖和胰島素抵抗的機制研究。電針能夠從控制進食、降低體質量、緩解炎癥、抑制交感神經興奮性、調節胰島素信號通路、促進脂質代謝等多個環節影響和治療肥胖與胰島素抵抗[16]。

胰島素抵抗肥胖屬于現代醫學概念，中醫并無與其相對應的病名。臨床上胰島素抵抗肥胖與糖耐量異常具有一定的相似性，是介于健康與患病之間的一種亞健康狀態。患者多表現為形體肥胖、倦怠懶言，或伴有脘腹脹滿、口淡無味或黏膩，舌淡有齒痕、舌苔白膩或厚膩，故可將其歸入“脾癉”范疇。《素問·奇病論篇》曰：“此五氣之溢也，名曰脾癉……此肥美之所發也，此人必數食甘美而多肥也。肥者令人內熱……轉為消渴”，強調從過食肥甘導致的肥胖到脾癉，再由脾癉到消渴的發病過程及病機。脾主運化水濕，脾虛失健運，津液不布、水液不化，導致濕濁內困、痰濁內生，而本虛標實是脾癉的發病特征。中醫發病學理論認為，“正氣存內，邪不可干”，強調人體正氣在疾病發生中的重要作用，治則上注重鼓舞人體正氣以扶正祛邪。針灸“標本配穴”，“標”即針對病邪選取“標穴”，局部選穴或隨證選穴疏導經氣以利導邪氣排除；“本”是指以正氣為本，選用“本穴”，即選取固護先天之氣(元氣)和后天之氣(胃氣)的穴位，以調動機體正氣，增強機體抵抗病邪能力[17]。肥胖胰島素抵抗中醫病機以脾虛為本，濕盛為標，因此在治療中亦需重視扶助正氣，扶正以祛邪。故在治療胰島素抵抗時，常選取關元、足三里為“本穴”，以固護先天之腎氣及后天脾胃之氣，取中脘、豐隆為“標穴”以祛肥胖痰濕之邪。近年來，此4穴均被多次報道用于治療肥胖及胰島素抵抗，并取得較好的療效，是臨床治療肥胖最為常用和有效的取穴[18]，也是“標本配穴”理論體系在臨床應用中的一大體現，同時也是針灸治未病學術思想在臨床應用中的體現。

作為脂肪細胞分泌的一種對抗胰島素抵抗的重要因子，脂聯素能夠通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(amp-activated protein kinase, AMPK)，刺激葡萄糖的利用和脂肪酸的氧化，進而清除血漿游離脂肪酸，改善肥胖導致的慢性炎癥狀態，增加胰島素敏感性[19-20]。脂聯素水平的增加能夠抑制脂肪組織分泌TNF-α，抑制炎癥反應，改善胰島素敏感性[21]。脂聯素還能夠增加胰島素受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTKs)和 p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, p38 MAPKs)的活性，加速胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1, IRS1)的酪氨酸磷酸化，從而促進葡萄糖的攝取，改善血糖[22]。最新研究發現，脂肪細胞中脂聯素的基因表達受到環磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)、FoxO1等多種轉錄因子的調控，胰島素受體介導FoxO1去磷酸化之后進入細胞核，能夠抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)介導的脂聯素基因表達[23]；細胞核內的FoxO1與C/EBP形成復合后，能夠與脂聯素基因的啟動子結合，進行促進其表達，SIRT1介導的去乙酰化能夠激活FoxO1與C/EBP復合物，進而調控脂聯素的基因表達[24]。

圖2顯示，在本實驗結果中發現，肥胖大鼠血清脂聯素水平明顯低于正常大鼠，同時還伴隨著明顯的胰島素抵抗。在接受8周的電針治療后，肥胖大鼠的血清胰島素水平出現下調，胰島素敏感性明顯改善，血清脂聯素水平也較模型大鼠出現明顯的降低。通過檢測各組大鼠白色脂肪組織的蛋白表達發現，與正常大鼠比較，高脂誘導的肥胖大鼠白色脂肪組織中SIRT1、FoxO1、脂聯素的蛋白表達明顯下調，在接受電針治療后SIRT1和脂聯素的蛋白表達水平出現了明顯上調，而FoxO1只出現了輕度的上調，但無統計學意義。通過檢測白色脂肪組織中SIRT1、FoxO1、脂聯素的基因表達水平，發現正常大鼠SIRT1、FoxO1、脂聯素的基因表達水平仍明顯高于肥胖大鼠，但電針并不能上調肥胖大鼠SIRT和FoxO1的基因表達，卻能夠上調脂聯素的基因表達。綜合以上結果說明，電針促進脂聯素合成的主要靶點可能在SIRT1的轉錄后調控，電針可能通過上調SIRT1的蛋白表達水平，從而調節FoxO1-C/EBP復合物，進而影響下游脂聯素的基因表達，最終達到促進白色脂肪組織合成脂聯素、改善胰島素抵抗的目的。但是本研究仍存在一些局限性，電針介導SIRT1蛋白表達的上調與FoxO1-C/EBP復合物激活存在何種聯系需要在后期實驗中進行深入研究。

圖2 電針調控白色脂肪組織脂聯素基因表達的可能機制

綜上所述，電針能夠明顯改善高脂飲食誘導的肥胖大鼠的胰島素抵抗狀態，其作用機制可能與電針調控白色脂肪組織中SIRT1/FoxO1通路進而影響脂聯素的基因表達有關，為臨床開展針灸防治肥胖與胰島素抵抗提供客觀的實驗證據。