應(yīng)用季節(jié)性流感病毒H3N2鼠適應(yīng)株建立小鼠模型

姜 靜，呂 琦，李楓棣，戚菲菲，王順意，王冠澎，徐艷峰，鮑琳琳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100021)

流感病毒(influenza virus)是引起人和動(dòng)物傳染病流行最重要的病原體之一，目前已經(jīng)在世界上導(dǎo)致五次人群中的大規(guī)模流行。自1918年西班牙H1N1流感大流行后，1957年亞洲H2N2、1968年香港H3N2、1977年俄羅斯H1N1及2009年墨西哥H1N1流感大流行相繼出現(xiàn)，造成人力、物力等資源的巨大損失，其中僅在1968～1969 年香港H3N2流感大流行中就有約100 萬人被奪去了生命[1-3]。H3N2自1968年香港大流行以來，幾乎每年均以季節(jié)性流感的形式在我國頻繁出現(xiàn)[4-6]，是我國季節(jié)性流感的主要病毒株，已成為疫苗備選株的重要篩選對(duì)象。隨著H3N2亞型流感病毒在人群中不斷的進(jìn)化、變異，預(yù)防流感或流感嚴(yán)重并發(fā)癥的疫苗至今也已更新三十余次[7-9]。與以往相比，近年來H3N2發(fā)生了較大變異，導(dǎo)致被感染人的數(shù)量顯著增多、癥狀明顯加重[10-13]，亟需開展研發(fā)相應(yīng)的治療藥物、疫苗等流感疫情應(yīng)對(duì)工作。

BALB/c小鼠是流感病毒致病性與疫苗研究常用的動(dòng)物模型之一[14-16]。季節(jié)性流感病毒H3N2并不能直接感染小鼠，國際上大多采用建立鼠適應(yīng)株、反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建整合毒株的方式建立小鼠模型[17-23]，目前國內(nèi)還未建成H3N2流感病毒適應(yīng)株[24-25]。面對(duì)國內(nèi)目前不斷出現(xiàn)突變的H3N2流感病毒，新型疫苗株篩選、有效性評(píng)價(jià)急需H3N2動(dòng)物模型。本文通過篩選合適的H3N2流感病毒株建立H3N2鼠適應(yīng)株，并應(yīng)用其建立小鼠模型，將為疫苗株篩選、疫苗和抗體有效性評(píng)價(jià)提供合適的研究工具，為季節(jié)性流感防控提供有力的實(shí)驗(yàn)室支撐。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠60 只，4～6 周齡，體重13～15 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]。所有的感染實(shí)驗(yàn)均在動(dòng)物生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室(ABSL-2)中進(jìn)行，所有操作經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)(BLL18004)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循3R原則。

季節(jié)性流感病毒A/Aichi/2/68(H3N2)(WT)，由香港大學(xué)陳鴻霖教授惠贈(zèng)。H3N2鼠適應(yīng)株(MA-7)由本實(shí)驗(yàn)室在BALB/c小鼠體內(nèi)7 次適應(yīng)獲得。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組

4～6 周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成2 組，每組30 只，設(shè)立WT組(對(duì)照組)和MA-7組(實(shí)驗(yàn)組)，分別用A/Aichi/2/68(H3N2)WT和鼠適應(yīng)株(MA-7)滴鼻感染小鼠，感染劑量為每只106TCID50。在感染后第1、2、3、5、7和第9 天，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死3 只小鼠，取肺、心、肝、脾、腎、腸、腦、眼、氣管組織，用于病理檢查、病毒載量和病毒滴度的檢測(cè)。

1.2.2 病毒載量測(cè)定

提取組織的總RNA，進(jìn)行探針法熒光定量PCR (Rea1-time PCR)檢測(cè)。上、下游引物序列為：InfA-Fwd 5’-GACCGATCCTGTCACCTCTGAC -3’，InfA-Rev 5’- AGGGCATTCTGGACAAAGCGTCTA -3’, InfA-Prb5’FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG -BHQ1-3’。Real-time PCR反應(yīng)條件為：50℃ 30 min；95℃ 15 min；94℃ 15 s，60℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán)。

1.2.3 滴度測(cè)定

將組織勻漿接種于單層MDCK細(xì)胞中，37℃孵育1 h，PBS洗1遍，補(bǔ)充等體積的病毒培養(yǎng)液，72 h后收集細(xì)胞上清，加入火雞血進(jìn)行復(fù)檢。利用Reed-Munch公式計(jì)算組織細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)。

1.2.4 組織病理學(xué)檢查

將小鼠的肺、心、肝、脾、腎、腸、腦、眼、氣管組織進(jìn)行標(biāo)本制備，制備方法采用甲醛固定、石蠟包埋、切片，H.E和免疫組織化學(xué)染色。免疫組化使用NP單克隆抗體(1∶1000稀釋)，4℃過夜，PBS洗；加二抗(1∶1000稀釋)，室溫孵育，PBS洗； DAB顯色，蘇木素襯染后脫水、透明、中性樹膠封片。

1.2.5 基因組測(cè)序和比對(duì)

合成流感病毒8 個(gè)基因片段的PCR引物，對(duì)WT和MA-7的8 個(gè)基因片段進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序后使用DNAStar軟件包進(jìn)行序列拼接及比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀態(tài)和死亡情況

WT組小鼠感染后，無明顯癥狀變化，14 d內(nèi)無小鼠死亡。MA-7組小鼠感染后，出現(xiàn)弓背、豎毛、活動(dòng)遲緩、體型消瘦，第4天開始出現(xiàn)死亡，直至第9 天全部死亡。具體死亡情況見圖1。

2.2 小鼠體重變化

WT組小鼠感染后，小鼠體重持續(xù)上升，體重上升率最高可達(dá)14%。MA-7 組小鼠感染后第1天體重下降，一直持續(xù)至感染第9 天(小鼠全部死亡)逐漸下降，體重下降率峰值達(dá)到30%。小鼠感染后體重變化率見圖2。

圖1 鼠肺適應(yīng)株小鼠模型的死亡情況(n=10)Figure 1 The survival rate in the mice inoculated with WT and MA-7 virus

注：(a)圖中9組bar依次代表小鼠感染鼠肺適應(yīng)株(MA-7)后心、肺、氣管、脾、腎、腸、腦、眼、肝的病毒載量；(b) 圖中9組bar依次代表小鼠感染鼠肺適應(yīng)株(MA-7)后心、肺、氣管、脾、腎、腸、腦、眼、肝的病毒滴度。圖3 鼠肺適應(yīng)株小鼠模型各組織的病毒復(fù)制(n=3)Note. (a) The viral load in tissues of the mice infected with MA-7 virus. (b) The viral titer in tissues of the mice infected with MA-7 virus.Figure 3 Viral replication curves in tissues of the mice infected with MA-7 virus

圖2 鼠肺適應(yīng)株小鼠模型的體重變化(n=10)Figure 2 The loss of body weight in the mice inoculated with WT and MA-7 virus

2.3 病毒在各組織中復(fù)制動(dòng)態(tài)變化

在小鼠感染后第1～9 天，檢測(cè)MA-7組小鼠的肺、心、肝、脾、腎、腸、腦等組織內(nèi)的病毒復(fù)制情況，用于明確病毒復(fù)制的組織器官，并監(jiān)測(cè)其復(fù)制動(dòng)態(tài)變化，確定復(fù)制高峰期。結(jié)果顯示，肺、氣管、心、肝、腎均能檢測(cè)到病毒復(fù)制，其中以氣管和肺組織為主。MA-7組小鼠感染后，在第1～9 天均可在肺組織內(nèi)檢測(cè)到病毒復(fù)制，第2～5天為復(fù)制高峰期，最高可達(dá)到105.5TCID50。病毒在氣管中的復(fù)制能力低于肺組織，最高可達(dá)105.2TCID50，其可能與兩者的細(xì)胞表面受體分布特點(diǎn)相關(guān)。心、肝、脾、腎、腸、腦、眼組織均能檢測(cè)到病毒RNA，肝、腎組織在小鼠感染后第1～9 天間斷性地檢測(cè)到有病毒復(fù)制，其余組織均檢測(cè)不到。以上結(jié)果說明H3N2病毒復(fù)制只發(fā)生在呼吸系統(tǒng)中。具體結(jié)果如圖3所示。

2.4 小鼠模型的肺組織病理變化

MA-7組小鼠感染后可在肺、氣管、心、肝、腎組織內(nèi)可檢測(cè)到病毒復(fù)制，因此進(jìn)一步比對(duì)病毒入侵的這些組織臟器中引起的病理改變。檢測(cè)結(jié)果顯示，氣管、心、肝、腎組織均無明顯的病理變化。肺組織HE結(jié)果顯示，在感染后第1～5 天內(nèi)，隨著感染天數(shù)增加，肺組織病變嚴(yán)重程度增大。在感染后第1天，局部肺泡間隔輕度增寬，少數(shù)支氣管上皮細(xì)胞變性壞死；在感染后第3天，肺泡間隔明顯增寬，支氣管上皮細(xì)胞變性壞死，肺泡內(nèi)可見少量炎細(xì)胞滲出，血管周圍水腫，少量出血；在感染后第5天，肺組織呈現(xiàn)病毒性間質(zhì)肺炎，肺泡間隔增寬程度增加，部分區(qū)域肺泡腔消失，炎細(xì)胞浸潤，肺泡內(nèi)可見較多的炎細(xì)胞及漿液纖維素滲出，支氣管上皮細(xì)胞變性壞死，血管擴(kuò)張充血；在感染后第7天，肺組織病變略有減輕。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在感染后第1～5 天內(nèi)，抗原顆粒隨著感染天數(shù)呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。

2.5 基因比對(duì)

測(cè)序分析結(jié)果顯示，MA-7 基因序列共檢出5 個(gè)突變位點(diǎn)，分別位于第 1891、550、1447、868 及 1192 位，其中2 個(gè)突變發(fā)生在 HA 蛋白中(P162Q、N483P)，3 個(gè)突變分別發(fā)生在 NA、PA、NP 蛋白中(V398I、 G631S、D290 N)， 引起氨基酸殘基序列改變。具體結(jié)果如表1所示。

3 討論

抗流感病毒的藥物、疫苗和抗體評(píng)價(jià)以及新發(fā)流感病毒的致病性方面的研究都需要合適的動(dòng)物模型，流感動(dòng)物模型是藥物轉(zhuǎn)化應(yīng)用的必不可少的技術(shù)支撐。而近年來H3N2流感病毒不斷變異產(chǎn)生新的毒株，疫苗保護(hù)效果不理想，需要不斷提供新的疫苗株，同時(shí)也需要更有效的抗病毒藥物；而H3N2流感病毒，野生毒株不能直接感染小鼠[24-26]，沒有合適的動(dòng)物模型對(duì)于進(jìn)行一些疫苗評(píng)價(jià)和藥物評(píng)價(jià)是一個(gè)巨大的問題。本研究是應(yīng)用H3N2流感病毒小鼠適應(yīng)株建立相應(yīng)的模型。前期曾應(yīng)用5株病人分離到的H3N2流感病毒建立小鼠適應(yīng)株，經(jīng)過20代左右適應(yīng)，但病毒不能在小鼠體內(nèi)復(fù)制。另外其他研究機(jī)構(gòu)[27]將H3N2流感病毒(A/Anhui/137/2008)在BALB/c小鼠體內(nèi)傳代40次，也未能構(gòu)建H3N2的適應(yīng)株。本次實(shí)驗(yàn)應(yīng)用毒株A/Aichi/2/68(H3N2)，通過在BALB/c小鼠體內(nèi)多次適應(yīng)，期間通過不斷優(yōu)化組織的處理、病毒的富集方法，連續(xù)傳至7代后獲得敏感的鼠適應(yīng)株(MA-7)，并在此基礎(chǔ)上成功建立了小鼠模型。以上結(jié)果說明并不是所有H3N2流感病毒通過多次循環(huán)能夠獲得小鼠適應(yīng)性，并在小鼠體內(nèi)復(fù)制。本次構(gòu)建的H3N2適應(yīng)株小鼠模型可用于H3N2流感病毒發(fā)病機(jī)制及其相應(yīng)的藥物、疫苗、抗體評(píng)價(jià)等方面的研究。

MA-7(H3N2適應(yīng)株)可導(dǎo)致小鼠在感染后9天內(nèi)死亡，與野生毒株相比致病力顯著提升。實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)這種致病力的差異來自于病毒分子序列的改變。結(jié)果顯示，MA-7在HA、NA、PA、NP蛋白中出現(xiàn)了5個(gè)氨基酸突變，其中2個(gè)突變發(fā)生在HA蛋白中(P162Q、N483P)，3個(gè)突變分別發(fā)生在NA、PA、NP蛋白中(NA-V398I、 PA-G631S、NP-D290 N)，各位點(diǎn)的突變均未有報(bào)道。初步分析MA-7的基因多態(tài)性突變是致病力發(fā)生顯著性提升的分子基礎(chǔ)。上述突變位點(diǎn)的功能確認(rèn)還需通過反向遺傳學(xué)構(gòu)建相應(yīng)的突變毒株，逐個(gè)鑒定其功能。

注：上行顯示的是4周齡雌性BALB/c小鼠在感染鼠適應(yīng)株后肺組織HE(100倍)染色結(jié)果；下行顯示的是BALB/c小鼠在感染鼠適應(yīng)株后肺組織IHC(200倍)染色結(jié)果。圖4 流感病毒小鼠肺組織病理切片(HE，IHC)(n=3)Note. The upper line shows the results of the lung tissue HE staining of mice at 1,3,5 and 7 days after infection with MA-7 virus. The upper line shows the results of the lung tissue IHC staining of mice at 1,3,5 and 7 days after infection with MA-7 virus.Figure 4 Histological analysis of the lung tissues of the mice infected with MA-7 virus(HE,IHC staining)

病毒VirusPB2PB1PAHANPNAM2&M1NEP&NS1ntaantaantaantaantaa189163155016214474838682901192398WT--GGlyCProAAsnGAspGVal--MA-7--ASerAGlnGAspAAsnAlle--

注：WT： 野生株；MA-7： 鼠適應(yīng)株； nt, 堿基；aa, 氨基酸。

Note. WT, wild-type. MA-7, mouse-adapted. nt, nucleotide. aa, amino acid.

綜上所述，本次研究成功建立了季節(jié)性流感病毒H3N2適應(yīng)株小鼠模型，并發(fā)現(xiàn)HA(P162Q、N483P)、NA(V398I)、PA(G631S)、NP(D290 N)5個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變與其鼠適應(yīng)株的致病力增強(qiáng)相關(guān)，為進(jìn)一步研究流感病毒鼠肺適應(yīng)的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。