麥芪降糖丸對ob/ob小鼠血糖的影響

方 芳,沙娜·吾肯,田小葉,唐曉麗,楊 依,張晶璇, 譙志文,呂姍珊,周年華,孫建寧*

(1.北京中醫藥大學中藥學院中藥藥理系，北京 102488；2.重慶思科藥物研究所有限公司，重慶 400039)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病，大多數糖尿病患者屬于2型糖尿病且伴有胰島素抵抗，持續的高血糖可導致心腦血管疾病、糖尿病周圍神經病變等嚴重的并發癥，不僅給患者本人帶來肉體和精神的痛苦，也給社會帶來巨大的經濟負擔。故糖尿病的診治已成為國際關注的醫學問題[1-2]。

糖尿病屬于中醫學中“消渴癥”范疇。臨床多以氣陰兩虛證為多，表現為氣虛、五心煩熱、潮熱盜汗、口干口渴、舌紅苔黃等。麥芪降糖丸是由麥冬、黃芪、地黃、黨參、天花粉、五味子、女貞子、牡丹皮、白茅根組成，具有益氣養陰，生津除煩的功效，用于糖尿病氣陰兩虛證。前期研究已顯示該藥對四氧嘧啶聯合高脂飼料的2型糖尿病小鼠有明顯的降低血糖，改善胰島素抵抗等作用[3]。本研究旨在進一步觀察該藥對2型糖尿病ob/ob小鼠的血糖、胰島素水平及胰腺病理變化的影響，為該藥上市后藥效再評價提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性8周齡ob/ob轉基因小鼠75只，體重35～40 g，和SPF級雄性8周齡C57BL/6 J小鼠15只，體重18～22 g，均購自北京華阜康生物科技有限公司[SCXK(京)2014-0004]。在北京中醫藥大學動物實驗中心飼養[SYXK(京)2016-0038]。動物實驗倫理申請編號BUCM-4-2017031202-3030。動物室溫度20℃～25℃，相對濕度(50±5)%，12 h/12 h光照日夜循環，動物自由飲水，標準飼料喂養。

1.2 主要試劑與儀器

麥芪降糖丸，重慶希爾安藥業有限公司生產，批號：160902。臨床用量： 口服，一次6 g(1袋)，一日4次。按臨床人(60 kg體重)用量的20倍，10倍，5倍給藥，作為實驗中高、中、低劑量(8 g/kg、4 g/kg、2 g/kg)。鹽酸二甲雙胍片：中美上海施貴寶制藥有限公司生產，批號：AAL3478。每片0.5 g，按每天3次，每次1片用量，實驗劑量為250 mg/kg。血糖儀及血糖試紙購自Roche(羅氏)診斷產品(上海)有限公司； Mouse insulin ELISA測定試劑盒購自Millipore公司，批號：2900014。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與給藥

ob/ob小鼠適應性飼養后，隨機分為模型組、麥芪降糖丸高劑量組(8 g/kg)、麥芪降糖丸中劑量組(4 g/kg)、麥芪降糖丸低劑量組(2 g/kg)和陽性對照藥二甲雙胍組(250 mg/kg)。同時設正常對照C57BL/6 J組。每組15只(在給藥8周后，每組隨機抽取2只用于其他病理檢查)。除正常對照和模型組小鼠灌胃給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉外，麥芪降糖丸和二甲雙胍組分別灌胃給予相應劑量的藥物，10 mL/kg，每天1次，連續10周。

1.3.2 指標測定：

實驗過程中測定每組動物每日進食量，計算每組每只小鼠平均日進食量(相鄰兩天每組動物飼料的差值/每組動物數，共記錄10周進行統計分析)；小鼠禁食不禁水6～8 h后，剪尾尖取血用血糖儀測定空腹血糖。給藥10周時，稱取小鼠體重，摘眼球取血，室溫靜止1 h后，離心分離血清， Elisa試劑盒方法測定血清胰島素水平。每組6個胰腺樣本投入4%甲醛中固定，常規石蠟切片后HE染色，觀察組織病理學變化。

1.4 統計分析

2 結果

2.1 麥芪降糖丸對ob/ob小鼠平均日進食量和體重的影響

與正常對照組比較，ob/ob模型組及各給藥組小鼠的平均日進食量明顯增加 (P< 0.01)，體重明顯增加(P< 0.01)；與ob/ob模型組小鼠比較，連續灌胃給予麥芪降糖丸10周，對ob/ob小鼠的平均日進食量和體重無明顯影響；二甲雙胍對ob/ob小鼠的平均日進食量無明顯影響，但能增加小鼠的體重(P< 0.01)。見表1。

2.2 麥芪降糖丸給藥10周對ob/ob小鼠空腹血糖的影響

實驗結果顯示，給藥前ob/ob模型組及各給藥組小鼠的空腹血糖明顯比正常對照小鼠的空腹血糖高(P< 0.01)，但ob/ob模型組及各給藥組小鼠的空腹血糖無明顯差異。而給予麥芪降糖丸和二甲雙胍后均有降低ob/ob小鼠空腹血糖的趨勢，其中麥芪降糖丸低劑量在給藥2周、6周、8周、10周時及中劑量在給藥10周時有明顯的降低血糖的作用(P< 0.05，P< 0.01)。二甲雙胍在給藥4、6周、8周時有明顯的降低血糖的作用(P< 0.05，P< 0.01)。結果見表2。

2.3 麥芪降糖丸對ob/ob小鼠血清胰島素水平的影響

與正常對照組比較，ob/ob模型組及各給藥組小鼠的血清胰島素水平明顯增加(P< 0.01)；與ob/ob模型小鼠比較，給予麥芪降糖丸能增加ob/ob小鼠血清胰島素水平(P< 0.05)。二甲雙胍對ob/ob小鼠的血清胰島素水平未見顯著變化。見表3。

2.4 麥芪降糖丸對ob/ob小鼠胰腺病理變化的影響

HE染色結果顯示，正常對照組動物胰腺組織內胰島未見明顯異常病理改變，其余各實驗組均有全部或部分動物的胰島可見異常，主要表現為胰島增生、胰島肥大、增生或肥大的胰島內毛細血管增生或伴擴張，增生或肥大的胰島內胰島實質細胞密度增加或間質細胞增生；與模型對照組相比，麥芪降糖丸和二甲雙胍組動物胰島增生或肥大、增生或肥大的胰島內毛細血管增生或伴擴張的發生例數無明顯減少，但麥芪降糖丸組的病變程度略有降低；與模型對照組相比，麥芪降糖丸和二甲雙胍組動物的增生或肥大的胰島內胰島實質細胞或間質細胞增生發生例數有所減少，尤其是麥芪降糖丸高劑量組動物的增生或肥大的胰島內胰島實質細胞密度未見明顯增加。(見表4，圖1)

表1 麥芪降糖丸對ob/ob小鼠平均日進食量和體重的影響Table 1 Effects of Mai Qi Jiang Tang pill on body weight and average daily food intake of the ob/ob mice

注：與正常對照組比較，*P< 0.05,**P< 0.01。與ob/ob模型組比較，##P< 0.01。

Note. Compared with the normal control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the ob/ob model group,##P< 0.01.

表2 麥芪降糖丸給藥10周對ob/ob小鼠空腹血糖的影響Table 2 Effects of Mai Qi Jiang Tang pill on fasting blood glucose levels of the ob/ob mice

注：與正常對照組比較，*P< 0.05**P< 0.01。與ob/ob模型組比較，#P< 0.05,##P< 0.01。

Note. Compared with the normal control group, *P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the ob/ob model group，#P< 0.05,##P< 0.01.

表3 麥芪降糖丸對ob/ob小鼠血清胰島素水平的影響Table 3 Effects of Mai Qi Jiang Tang pill on serum insulin levels of the ob/ob mice

注：與正常對照組比較，**P< 0.01。與ob/ob模型組比較，#P< 0.05。

Note. Compared with the normal control group,**P< 0.01. Compared with the ob/ob model group，#P< 0.05.

表4 麥芪降糖丸對ob/ob小鼠胰腺病理變化的影響 (n=6)Table 4 Effects of Mai Qi Jiang Tang pill on pathological changes in the pancreas of ob/ob mice

注：表格中數字表示發生相應病理變化的動物例數。

Note. The number in the table indicates the number of animals with corresponding pathological changes.

圖1 麥芪降糖丸對ob/ob小鼠胰腺病理變化的影響(HE染色，×4)Figure 1 Effects of Mai Qi Jiang Tang pill on pathological changes in the pancreas of ob/ob mice. HE staining.

3 討論

ob/ob小鼠是瘦素基因缺陷的2型糖尿病動物模型，廣泛用于糖尿病的相關研究中[4]。瘦素是一種由脂肪細胞分泌的內分泌激素，其可通過中樞神經系統和外周組織調節機體能量代謝，發揮抑制食欲，促進脂肪分解，調節血糖穩態的生理功能。缺乏瘦素或瘦素受體的小鼠表現為攝食過量、肥胖、2型糖尿病和神經內分泌紊亂[4-5]。本研究結果已證實該模型的體重、進食量、血糖、胰島素水平均明顯高于同月齡正常對照組，證實該模型可用于2型糖尿病的發病機制及藥物研究。

麥芪降糖丸方中麥冬養陰潤肺，益胃生津，清心除煩，麥冬多糖能顯著降低2型糖尿病KKAy小鼠、高脂高糖飼料及小劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導的2型糖尿病小鼠空腹血糖水平及血脂水平，能改善糖尿病小鼠的葡萄糖耐受程度及胰島素抵抗[6]；黃芪補氣健脾，補中益氣，可降低高脂飼料和STZ誘導的2型糖尿病小鼠血糖、血脂和胰島素水平，改善胰島β細胞功能和胰島素抵抗[7]；地黃清熱涼血，養陰生津，地黃寡糖等成分具有降低STZ誘導的糖尿病小鼠血糖和血脂升高[8]；黨參補脾肺氣，增強補氣補血功效，所含多糖成分能降低四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠的血糖，改善氫化可的松琥珀酸鈉(HCSS)致小鼠的胰島素抵抗[9]；天花粉清熱瀉火，生津止渴，所含凝集素部位具有較強的降糖作用[10]；五味子收斂固澀，益氣生津，補腎寧心，五味子油還可以降低STZ誘導的2型糖尿病大鼠空腹血糖，改善胰島素抵抗，減輕胰島β細胞的損傷，增加β細胞數量，提高胰島素的分泌量[11-12]；女貞子滋補肝腎之陰，通過保護胰腺β細胞，刺激胰島素表達和分泌，加速葡萄糖的利用，產生降低血糖、調血脂、抗肥胖的藥理作用[13]；牡丹皮涼血清熱、活血散瘀，可以降低2型糖尿病的血糖，調節血脂代謝和抗氧化作用，可能與促進胰島細胞產生以及促進葡萄糖代謝有關[14]；白茅根清熱、涼血、止血，多糖成分具有調節STZ誘導的糖尿病小鼠血糖、血脂代謝紊亂的作用[15]；各藥共奏益氣養陰，生津除煩之功效，現代藥理研究結果為其治療糖尿病提供了實驗依據。本研究發現，麥芪降糖丸連續給予ob/ob小鼠10周，對ob/ob小鼠的每日平均進食量和體重未見明顯的影響，但能明顯降低ob/ob小鼠空腹血糖水平，特別是麥芪降糖丸低、中劑量降糖作用較顯著，而高劑量對ob/ob小鼠的空腹血糖影響不明顯，可能與麥芪降糖丸濃度高，灌胃后影響藥物吸收有關。此外，實驗過程中有動物死亡，特別是麥芪降糖丸高劑量組和二甲雙胍組動物死亡數量較多，研究人員推測，除動物自身狀態外，可能與濃度過高灌胃或降糖作用過強有關。實驗中二甲雙胍作為陽性對照藥，其血漿半衰期較短，在給藥后短時間內能明顯降低空腹血糖，但在末次測定前未提前給予藥物，導致距離前一天給予二甲雙胍的時間間隔較長，藥效減弱。

胰島素是體內降低血糖的主要成分，具有促進脂質合成、糖的吸收、有氧氧化和糖原合成、抑制糖異生、調節蛋白質合成和細胞生長分化的生理功能。持續性的高血糖可以刺激胰腺細胞分泌胰島素或通過增生合成分泌胰島素，維持血糖穩定。有研究表明，抑制ob/ob小鼠的高胰島素水平，可以快速誘發青年小鼠出現糖尿病，高胰島素水平是維持ob/ob小鼠血糖正常的條件[16]。本研究結果顯示，ob/ob小鼠胰腺胰島細胞增生，肥大，血糖高胰島素水平和高血糖，提示代償性的刺激胰島素分泌并未達到降低血糖的作用；給予麥芪降糖丸10周，ob/ob小鼠胰腺組織中胰島內實質細胞增生和間質細胞增生的例數和程度均有改善，空腹血清胰島素水平明顯增加。

綜上所述，本研究初步發現麥芪降糖丸具有改善ob/ob小鼠血糖的作用，可能與改善胰腺細胞病理變化，促進胰島素分泌有關，但還需要從胰島β細胞功能、糖耐量、糖異生等方面進一步深入研究，以期發現其確切的作用特點。