丹參酮ⅡA對擴張型心肌病大鼠心肌細胞凋亡及PI3K/Akt通路的影響

柴松波， 王振濤， 張淑娟， 劉舜禹

(河南省中醫院/河南中醫藥大學第二附屬醫院心病科，鄭州 450002)

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)為臨床常見心臟疾病，患者常出現心室收縮功能障礙、心室重構，若沒有得到及時治療，則會病情加重，發展為心力衰竭[1]。近期研究顯示心肌細胞凋亡是導致DCM發生時心室收縮功能不足、左心室功能惡化的主要原因，因此抑制心肌細胞凋亡可緩解心肌損傷以及心室重構[2]。丹參酮ⅡA為丹參中具有代表性的生物活性成分，丹參酮ⅡA 磺酸鈉(sodium tanshinone ⅡA sulfonate, STS)為其主要提取物，大量研究顯示在心肌缺血再灌注損傷、心肌肥大、DCM中均具有良好的療效，然而其具體作用機制目前尚不明確[3]。本研究通過制備DCM大鼠，并給予STS治療，以觀察STS對DCM大鼠心肌細胞凋亡的改善作用，并初步探討可能作用機制，以期為STS應用于心肌梗死臨床治療提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取7～8周齡SPF級雄性 Wistar大鼠72只，體重60～70 g, 由河南省動物實驗中心提供[SYXK(豫)2017-0002]，所有大鼠均在22℃～25℃，相對濕度50%的環境中統一飼養[SYXK(豫)2017-0016]，大鼠自由飲水、攝食，保持通風、光照良好，正常飼養一周后用于模型制備。本研究經本院實驗動物倫理委員會批準同意，且實驗過程中的處理符合動物倫理學標準，倫理審批號：IACUC-20170208015。

1.2 主要試劑與儀器

STS注射劑購于上海第一生化藥業有限公司，批號：20170218；卡維地洛(carvedilol，CAR)購于齊魯制藥有限公司，批號：20170326；呋喃唑酮片購于長春新安藥業有限公司批號：20170121；多普勒超聲檢測儀購于西門子公司；HE染色試劑盒購于上海生工生物工程有限公司；Tunel檢測試劑盒購于杭州碧云天生物科技有限公司；蛋白檢測試劑盒、BCA測定試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗鼠p-PI3K、p-Akt、caspase3、B淋巴細胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、(Bcl-2 associated X protein，Bax)單抗購自英國Abcam公司，HRP標記IgG二抗、βactin均購自美國Sigma公司；電子顯微鏡購于日本奧林巴斯公司；垂直電泳儀與凝膠成像儀購于美國Bio-Rad公司；SP檢測試劑盒購于北京康為世紀公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備

參照文獻[4]制備DCM大鼠，選取60只大鼠，灌胃呋喃唑酮水溶液(按1 kg水加700 mg呋喃唑酮配置)，每日更換一次。造模時間為8周。并用超聲診斷儀完成心臟超聲心動圖監測，超聲心動圖顯示左心室壁彌漫性運動減弱，射血分數較對照組大鼠射血分數均值減少20%為造模成功的標志。另設一正常對照組大鼠12只，自主飲水連續8周。

1.3.2 動物分組與給藥

模型制備后，采用隨機數字表法將大鼠分為5組，模型組(DCM組)、STS中、高、低劑量組、CAR組，每組12只大鼠，STS各組大鼠：模型結束后腹腔注射17.5、35.0、70.0 mg/kg STS；卡維地洛組(陽性對照組)：模型結束后腹腔注射10 mg/kg CAR；每日上午1次，連續給藥4周。對照組、DCM組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，連續4周。

1.3.3 超聲檢測左心室功能。

末次給藥結束后，麻醉大鼠，于二維超聲引導下測定左心長軸切面左室收縮末期內徑(left ventricular internal diameter at end-systole, LVIDs)和左心室舒張末期內徑(left ventricular internal dimension at end-diastole, LVIDd)以及左心室射血分數(Left ventricular ejection fraction，LVEF)，連續測定4個完整心動周期，重復測定3次，取平均值。

1.3.4 標本采集

心功能檢測結束后，麻醉后處死大鼠，腹動脈取血2 mL，3000 r/min離心5 min后保留上層血清；取出心臟，清洗后，摘除非心肌組織，取心室橫徑最大部分心肌組織，一部分于-80℃中保存，一部分置于4%多聚甲醛中固定。

1.3.5 血清TNF-ɑ、IL-6水平檢測

采用Elisa試劑盒檢測血清中TNF-ɑ、IL-6水平，具體參照試劑盒說明書進行操作。

1.3.6 心肌組織染色

常規制備心肌組織石蠟切片，烘烤后，在二甲苯中脫蠟，梯度乙醇中脫水，PBS清洗后，采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin， HE)染色試劑盒進行染色，將切片置于顯微鏡下，觀察心肌組織病理形態學變化，統計心肌纖維化情況，無心肌纖維化為0分，纖維化區域比例<25%為1分，纖維化區域比例25%～50%記為2分，51%～75%記為3分，>75%記為4分。

Masson染色：石蠟切片加入、脫蠟脫水后進行鉻化處理，參照Masson染色試劑盒進行染色，切片最后脫水、透明、封片后。采用Metic Med 6.0軟件計算心肌膠原纖維比例(%)=膠原面積/總面積 × 100%。

1.3.7 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡情況

制備心肌組織冷凍切片，根據TUNEL染色試劑盒說明書對組織進行染色，于光學顯微鏡下觀察心肌細胞凋亡數情況，Image-Pro Plus軟件定量細胞陽性數量，計算心肌細胞凋亡指數(apoptosis index,AI)=凋亡細胞陽性數/細胞總數 × 100%。

1.3.8 蛋白免疫印跡

取出保存心肌組織研磨，添加裂解緩沖液裂解組織，抽提總蛋白，SDS-PAGE電泳分離等量蛋白后進行轉模反應后，加入5% BSA封閉1 h；加入p-PI3K、p-Akt、caspase-3、Bax、Bcl-2、β-actin一抗(1∶500)，4℃過夜孵育；添加二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h，發光顯影后用Tanon軟件采集圖像并對蛋白進行量化分析。

1.3.9 免疫組化檢測p-PI3K、p-Akt、caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達

心肌組織切片石蠟切片添加檸檬酸鈉抗原修復，H2O2解除內源過氧化酶活性，封閉后，于4℃加入p-PI3K、 p-Akt、caspase-3、 Bax、Bcl-2一抗孵育過夜，滴加HRP標記IgG二抗后，添加蘇木精染液復染、氨水反藍，置于梯度乙醇中脫水、二甲苯透明，用中性樹脂封片后置于顯微鏡下觀察蛋白表達情況。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 STS對DCM大鼠左心室功能的影響

與對照組相比，DCM組LVIDs、LVIDd升高，LVEF降低，差異具有顯著性(P<0.05)；與DCM組相比，STS各組以及CAR組LVIDs、LVIDd降低，LVEF升高，差異具有顯著性(P<0.05)。(圖1、表1)

2.2 DCM大鼠心肌組織病理學變化情況

對照組心肌細胞結構形態完整，心肌細胞以及膠原纖維排列緊密、規則。DCM組大鼠心肌細胞結構破碎，出現壞死，細胞排列疏松、膠原纖維斷裂、排列不規則，同時伴有大量炎性細胞浸潤。STS各組以及CAR組大鼠破碎、壞死心肌細胞明顯減少，細胞以及膠原纖維形態結構逐漸恢復正常。

與對照組相比，DCM組心肌組織病理學評分、心肌膠原纖維比例均升高，差異具有顯著性(P<0.05)；與DCM組相比，STS各組以及CAR組病理學評分、心肌膠原纖維比例均降低，差異具有顯著性(P<0.05)。(圖2、表2)

2.3 STS對DCM大鼠血清TNF-ɑ、IL-6水平的影響

與對照組相比，DCM組TNF-ɑ、IL-6水平均升高，差異具有顯著性(P<0.05)；與DCM組相比，STS各組以及CAR組TNF-ɑ、IL-6水平均降低，差異具有顯著性(P<0.05)；TNF-ɑ、IL-6水平均呈劑量依賴性(P<0.05)。(表3)

圖1 超聲檢測大鼠心臟的左心室功能Figure 1 Echocardiographic detection of the left ventricular function in the rats

組別Groups LVIDs(mm)LVIDd(mm)LVEF(%) 對照組Control group1.86±0.174.46±0.6485.33±7.87DCM組DCM group2.54±0.25?6.94±0.87?69.95±4.31?STS-L組STS-L group2.31±0.28#6.27±0.59#75.15±3.96#STS-M組STS-M group2.27±0.33#6.14±0.41#76.33±6.28#STS-H組STS-H group2.19±0.25#5.87±0.55#77.94±4.67#CAR組CAR group2.08±0.14#5.71±0.68#79.75±5.84#

注：與對照組比較，*P<0.05；與DCM組比較，#P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the DCM group,#P<0.05.

圖2 大鼠心肌組織的病理改變。HE、Masson染色Figure 2 Histological changes in the myocardium of the rats. Hematoxylin and eosin, and Masson trichrome staining

組別Groups 病理學評分Pathological scores心肌膠原纖維比例Myocardial collagen fiber ratio 對照組Control group0.16±0.036.52±0.31DCM組DCM group3.67±0.56?56.42±7.39?STS-L組STS-L group3.25±0.33#45.73±5.41#STS-M組STS-M group2.88±0.29#&34.21±6.32#&STS-H組STS-H group2.09±0.28#&△30.72±4.37#&CAR組CAR group1.96±0.35#24.66±3.51#

注：與對照組比較，*P<0.05；與DCM組比較，#P<0.05；與STS-L組比較，&P<0.05；與STS-M組比較，△P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the DCM group,#P<0.05. Compared with the STS-L group,&P<0.05. Compared with the STS-M group,△P<0.05.

表3 各組血清TNF-ɑ、IL-6水平比較Table 3 Serum TNF-ɑ and IL-6 levels in each group

注：與對照組比較，*P<0.05；與DCM組比較，#P<0.05；與STS-L組比較，&P<0.05；與STS-M組比較，△P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the DCM group,#P<0.05. Compared with the STS-L group,&P<0.05. Compared with the STS-M group,△P<0.05.

2.4 STS對DCM大鼠心肌細胞凋亡的影響

與對照組相比，DCM組心肌細胞AI升高，差異具有顯著性(P<0.05)；與DCM組相比，STS各組以及CAR組心肌細胞AI均降低，差異具有顯著性(P<0.05)；隨著劑量的升高，心肌細胞凋亡率降低(P<0.05)。(圖3、表4)

2.5 Western blot法檢測大鼠心肌組織p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、caspase-3、Bax蛋白表達

圖3 TUNEL法觀察各組大鼠心肌細胞凋亡情況(×100)Figure 3 Apoptosis in cardiomyocytes in the rat heart tissues in each group. TUNEL staining.

組別Groups 細胞凋亡(%)Apoptosis index 對照組Control group11.56±1.32DCM組DCM group42.17±3.78?STS-L組STS-L group32.81±3.26#STS-M組STS-M group25.37±3.01#&STS-H組STS-H group19.56±2.27#&△CAR組CAR group18.74±2.34#

注：與對照組比較，*P<0.05；與DCM組比較，#P<0.05；與STS-L組比較，&P<0.05；與STS-M組比較，△P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the DCM group,#P<0.05. Compared with the STS-L group,&P<0.05. Compared with the STS-M group,△P<0.05.

與對照組相比，DCM組p-PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表達降低，caspase-3、Bax蛋白表達升高，差異具有顯著性(P<0.05)；與DCM組相比，STS各組以及CAR組p-PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表達升高，caspase-3、Bax蛋白表達降低，差異具有顯著性(P<0.05)；p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、caspase-3、Bax蛋白表達呈劑量依賴性(P<0.05)。(圖4、表5)

2.6 免疫組化法檢測各組大鼠心肌p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、caspase3、Bax蛋白陽性表達情況

與對照組相比，DCM組p-PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白陽性表達率降低，caspase-3、Bax陽性表達率表達升高，差異具有顯著性(P<0.05)；與DCM組相比，STS各組以及CAR組p-PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白陽性表達率升高，caspase-3、Bax蛋白陽性表達率降低，差異具有顯著性(P<0.05)；隨著STS劑量的升高，caspase-3、Bax蛋白陽性表達率逐漸降低，p-PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表達顯著升高。(圖5、表6)

注：A：對照組；B：DCM組；C：STS-L組；D：STS-M組；E：STS-H組；F：CAR組。圖4 Western blot檢測心肌組織中p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、caspase-3、Bax蛋白表達Note. A, Control group. B, DCM group. C, STS-L group. D, STS-M group. E, STS-H group. F, CAR group.Figure 4 The expressions of p-PI3K, p-Akt, Bcl-2, Caspase-3 and Bax in the rat myocardial tissues of each group, detected by western blotting

表5 各組心肌p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、caspase-3、Bax蛋白表達的比較Table 5 Comparison of protein expressions of p-PI3K, p-Akt, Bcl-2, Caspase-3 and Bax in the rat myocardia of different groups

注：與對照組比較，*P<0.05；與DCM組比較，#P<0.05；與STS-L組比較，&P<0.05；與STS-M組比較，△P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the DCM group,#P<0.05. Compared with the STS-L group,&P<0.05. Compared with the STS-M group,△P<0.05.

圖5 心肌組織中p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、caspase-3、Bax蛋白的表達。免疫組化染色。Figure 5 Expression of p-PI3K, p-Akt, Bcl-2, caspase-3, and Bax proteins in the rat myocardial tissues. Immunohistochemical staining.

組別Groups p-PI3Kp-AktBcl-2Caspase-3Bax 對照組Control group60.34±6.4466.73±6.1848.17±6.7410.86±2.1310.57±1.82DCM組DCM group13.58±2.13?15.16±3.09?11.27±2.09?48.08±5.29?45.19±4.03?STS-L組STS-L group20.16±2.87#22.63±3.17#19.14±2.27#32.13±9.18#38.13±3.48#STS-M組STS-M group29.24±3.16#&34.52±5.37#&32.72±3.15#&28.17±4.34#29.18±2.24#&STS-H組STS-H group38.47±3.35#&△46.53±7.48#&△38.17±6.74#&△23.08±4.18#&△18.87±4.03#&△CAR組CAR group54.08±1.59#54.26±6.87#41.42±3.43#21.16±1.35#17.74±3.39#

注：與對照組比較，*P<0.05；與DCM組比較，#P<0.05；與STS-L組比較，&P<0.05；與STS-M組比較，△P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the DCM group,#P<0.05. Compared with the STS-L group,&P<0.05. Compared with the STS-M group,△P<0.05.

3 討論

DCM主要表現為心室擴張以及收縮功能減弱，調查顯示1985年美國某地區流行病學調查顯示DCM患病率為36.5/10萬，2002年中國分層整群抽樣調查顯示DCM患病率約為19/10萬，且近幾年發病率仍逐漸升高，嚴重影響患者生命健康[5]。DCM具體發病原因目前尚不明確，缺乏有效治療手段，因此探究其發病機制，尋找新型治療藥物是目前的重要任務。

本研究通過灌胃呋喃唑酮水溶液制備DCM大鼠，結果顯示與對照組比較，DCM組DCM組LVIDs、LVIDd升高，LVEF降低，血清TNF-ɑ、IL-6水平升高，HE染色發現心肌細胞形態破碎，排列疏松，出現大量炎性細胞浸潤，表明DCM大鼠左心室擴張，收縮功能降低，且心肌組織伴有炎癥損傷，符合以往DCM模型典型特征[6]，提示DCM模型復制成功。

STS是從中草藥丹參莖中提取的二萜醌類化合物，通過磺化反應制成的藥物，其中丹參酮ⅡA為主要藥理成分，藥理學研究顯示丹參酮ⅡA能夠降低血液黏稠度,消除過量氧自由基，使冠狀動脈擴張，提高心肌組織血流量，進而提高心肌能量儲備，使心肌收縮力增強[7]。本研究顯示與DCM組比較，STS各組LVIDs、LVIDd降低，LVEF升高，血清TNF-ɑ、IL-6水平降低，HE染色發現心肌細胞壞死數減少，心肌細胞以及膠原纖維形態逐漸恢復正常，炎性細胞浸潤明顯較少，隨著STS劑量的升高，大鼠心臟功能逐漸恢復，心肌損傷程度逐漸降低，且STS高劑量組與CAR組效果相似。劉崇斌等[8]研究發現，STS可改善DCM大鼠心功能，減輕左室重構，減少心肌纖維化進而保護心肌組織，與本研究結果一致。以上研究結果提示STS可緩解大鼠心肌損傷，改善DCM大鼠左心室功能保護心肌組織。

心肌組織受損是由多因素共同參與、作用的結果，與細胞凋亡密切相關。一般情況細胞凋亡有利于維持機體健康狀態非常重要；當細胞受到外界以及內部刺激時，細胞正常凋亡程序紊亂，引發細胞異常凋亡，引起組織細胞壞死等病理損傷[9-10]。本研究發現，與對照組比較，DCM組心肌細胞凋亡指數顯著升高；與DCM組比較，STS組大鼠心肌細胞凋亡指數顯著降低，提示STS能夠有效抑制DCM大鼠心肌細胞凋亡。

本研究顯示與對照組比較，DCM組心肌p-PI3K、p-Akt表達降低，表明活PI3K/Akt信號通路可能參與DM的發生。PI3K作為PI3K/Akt信號通路起始因子，在機體內生長因子、能量信號改變后激活IRS，隨后結合PI3K，產生PTP2以及PTP3，Akt在PTP2的刺激下產生二聚體并在PTP3、PDK的共同作用下使AKT與細胞膜相結合，進一步使Akt發生磷酸化，隨后從細胞膜上釋放出來進入細胞質內傳遞信號[11-12]。過往研究顯示STS通過調控PI3K/Akt/mTOR信號通路抵抗抗內皮細胞氧化應激損傷[13]。金云曄等[14]研究顯示STS通過調控PI3K/Akt/mTOR信號通路降低因缺血再灌注損傷導致的心肌細胞凋亡，保護心肌功能。李佳等[15]研究顯示，給予心肌缺血再灌注損傷大鼠PI3K特異性抑制劑后，大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高。以上研究表明，在心肌缺血再灌注損傷大鼠中發現激活PI3K/Akt信號通路，能夠保護心室功能，降低心肌梗塞面，減少心肌壞死細胞[16]。本研究發現與DCM組比較，STS組大鼠心肌組織中p-PI3K、p-Akt表達升高，隨著STS劑量的升高p-PI3K、p-Akt表達升高，逐漸升高，STS高劑量組與CAR組表達水平相近，提示STS可能通過激活PI3K/Akt信號通路抑制DCM大鼠心肌細胞凋亡，進而緩解心肌組織損傷，保護心肌功能。

細胞凋亡過程中涉及多種凋亡誘導、抑制因子，Bcl-2家族中包括多種與細胞凋亡密切相關的蛋白成員，包括Bcl-2抗凋亡因子以及促凋亡因子Bax[17]。細胞未受損時，Bcl-2、Bcl-XL與Bax形成二聚體，受到損傷刺激后Bax蛋白大量表達，二聚體含量升高聚集于線粒體膜導致線粒體膜通透性增加，AIF凋亡因子進入細胞質，激活caspase-3級聯反應引發細胞凋亡[18-19]。本研究發現，DCM組caspase-3、Bax表達顯著升高，Bcl-2表達顯著降低；STS干預后，caspase-3、Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高，隨著STS劑量的升高，caspase-3、Bax蛋白表達逐漸降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高，STS高劑量組與CAR組表達相近，提示STS可抑制caspase-3信號通路的激活抑制細胞凋亡，結合以上研究提示STS可能通過激活PI3K/Akt信號通路，進而抑制caspase-3凋亡通路激活，減少心肌細胞凋亡，發揮心肌損傷保護作用。

綜上所述，STS可減輕DCM大鼠心肌損傷，減少心肌細胞凋亡，其機制可能與激活PI3K/Akt信號通路，抑制caspase-3凋亡通路激活有關，但STS僅能部分緩解心肌組織損傷并非完全逆轉，這可能與藥物劑量有關，也有可能是其它因素造成，還有待后續深入研究，以期為DCM的治療提供充分的實驗依據。