氟中毒大鼠骨、肝、腎及腦組織的病理學變化

李博研，張 卓，周 波，郭連瑩，王曉紅，于 葉，胡博森

(沈陽醫學院公共衛生學院，遼寧省高等學校環境與人口健康重點實驗室，沈陽 110034)

自然界中，氟元素常以氟化物的形式穩定存在。在高氟環境條件下，機體長期過量攝入氟化物，可使其在體內廣泛蓄積，最終導致慢性氟中毒。在我國，氟中毒是危害較為嚴重的一種地方病，屬于全身中毒性疾病，除了可以引起以骨代謝紊亂為典型特征的氟骨癥，還可造成肝、腎及中樞神經系統等非骨相組織的功能異常[1-3]。目前，氟中毒病因已明確，雖然其致病機制尚未完全清楚，但多數學者認為[1,4-5]，氟的毒性損傷作用與機體氧化應激狀態密不可分。本研究通過對正常大鼠和慢性氟中毒模型大鼠的比較，主要從形態學角度觀察氟化鈉引起實驗大鼠骨相和非骨相組織的病理學改變，為探討氟中毒的毒性機理、深入研究氟中毒器官組織損傷及其防治措施提供基礎科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

20只斷乳4周齡，體重65～75 g，清潔級SD大鼠(雌雄各半)購自中國醫科大學實驗動物部[SCXK(遼)2013-0001]。常規喂養1周后，根據體重均衡的原則將大鼠隨機分為對照組和氟中毒組，每組10只(雌雄各半，分籠飼養)。對照組飲用自來水(F-濃度：0.4536 mg/L)，氟中毒組飲用含氟化鈉(NaF)的自來水(F-濃度：100 mg/L)；兩組大鼠均喂飼市售普通顆粒飼料。實驗在中國醫科大學實驗動物室[SYXK(遼)2013-0007]進行。實驗共持續12周，期間，保持動物室良好通風，室溫20℃～25℃，相對濕度(60±10)%，實驗大鼠自由攝食、攝水，定期稱重，并觀察日常活動狀態。按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

HITACHI H-7650透射電鏡(日本日立公司)；SpectraMax Plus384高通量酶標儀(美國Molecular Devices公司)；CSB-F-1型氟離子選擇電極(長沙半導體材料廠)。氟化鈉(Sigma，USA)；東盛牌普通飼料(沈陽市于洪區前民飼料廠)；多聚甲醛(上海圻明生物科技有限公司)；戊二醛(上海雙博生物科技有限公司)；四氧化鋨(北京寰宇科創生物科技發展有限公司)；檸檬酸鉛(北京達昱科儀科技有限公司)；丙二醛試劑盒(南京建成生物工程研究所)；考馬斯亮蘭試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 實驗方法

實驗周期結束，各組大鼠稱重，測量身長、尾長，采用大鼠氟斑牙分度方法[6]記錄氟斑牙發生情況。隨后，所有大鼠麻醉后，腹主動脈采血，分離血清，處死后，迅速分離股骨、肝、腎及腦組織，除股骨外，同一臟器取相同部位組織進行MDA含量測定；每組抽取6只大鼠(雌雄各半)組織樣本，用于氟含量測定；另取雌雄大鼠各1只組織樣本，用于光鏡標本制備和觀察；剩余2只大鼠組織樣本用于電鏡標本制備。具體按下列步驟進行操作：

1.3.1 氟含量測定

參照相關文獻方法，骨組織中氟含量采用管式爐高溫燃燒水解法進行測定[7]，軟組織氟含量采用氟離子選擇電極法進行測定[8]。

1.3.2 MDA含量測定

血清中MDA含量按照說明書進行操作，MDA(nmol/mL)=(測定管的OD值-測定空白管的OD值)/(標準管的OD值-標準空白管的OD值)×標準品的濃度×稀釋倍數。組織中MDA含量測定，首先準確稱取待測組織的重量，按照重量體積比加預冷生理鹽水，使用勻漿器在冰上操作將標本勻漿充分，制成10%的組織勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清液，再按照說明書要求進行操作，MDA(nmol/mgprot)=(測定管的OD值-測定空白的OD值)/(標準管的OD值-標準空白管的OD值)×標準品濃度/樣品蛋白質含量。

1.3.3 光鏡標本制備

各組織樣本均用4%多聚甲醛固定72 h(股骨固定后需用10% EDTA脫鈣)。固定結束后，流水沖洗3 h。石蠟常規包埋后，機械切片，伊紅-蘇木素普通染色，顯微鏡下觀察組織形態。

1.3.4 電鏡標本制備

取股骨干骺端松質骨塊，其他組織取相同部位組織塊，均用2.5%的戊二醛溶液固定24 h(骨組織需EDTA脫鈣)。小心清洗后，用1%的四氧化鋨溶液固定，乙醇梯度脫水，環氧樹脂包埋，機械加工制備超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察細胞形態。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 實驗動物一般狀況

實驗期間，氟中毒組大鼠攝食量、攝水量、體重、身長及尾長均略低于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。氟中毒組大鼠行為表現未見明顯異常。

2.2 氟斑牙發病情況

對照組大鼠未見氟斑牙發生，表現為門齒生長發育良好，牙面為棕黃色，表面光滑有光澤，透明度好無破損。氟中毒組大鼠氟斑牙發病率為100%，出現不同程度的氟斑牙，其中輕度4只、中度5只、重度1只，表現為實驗初期大鼠門齒出現棕白橫紋，后期橫紋加重，齒面著色不勻，部分區域呈白堊狀改變，牙面粗糙，光澤減退，重者出現破損，見表2和圖1。

2.3 各組大鼠組織中氟含量

表3結果顯示，氟中毒組大鼠骨氟、肝氟、腎氟及腦氟含量均顯著高于對照組大鼠(P<0.01)。

2.4 各組大鼠不同組織中MDA含量

氟中毒組大鼠血清及肝、腎、腦組織中MDA含量均顯著高于對照組大鼠(P<0.01或P<0.05)，見表4。

表1 各組大鼠一般狀況Table 1 General conditions of the rats in each group

表2 各組大鼠氟斑牙發生情況(n=10)Table 2 Incidence of dental fluorosis of rats in each group

注：A：正常；B：輕度；C：中度；D：重度。圖1 各組大鼠氟斑牙情況Note. A， Normal. B， Mild. C， Moderate. D， severe.Figure 1 Dental fluorosis of rats in each group

2.5 光鏡下各組織的病理學改變

光鏡結果顯示，對照組大鼠骨小梁致密完整，網狀結構排列均勻、整齊；氟中毒組大鼠骨小梁粗細不均，小梁間距增大、髓腔擴大，有部分斷裂發生(圖2 a,b)。對照組肝組織輪廓清楚，肝細胞索排列有序，胞漿紅染，細胞核大、圓且居中；氟中毒組大鼠肝細胞部分水腫明顯，肝細胞索排列紊亂，胞漿結構疏松，肝細胞輪廓不清(圖2 c,d)。對照組大鼠腎皮質近曲小管上皮細胞排列整齊，核圓形，染色質分布均勻，腎小球囊壁完整，系膜細胞和足細胞未見異常；氟中毒組大鼠腎皮質近曲小管可見上皮細胞腫脹、溶解、壞死，管腔增大，腔內可見脫落的上皮細胞(圖2 e,f)。對照組大鼠海馬區神經細胞排列正常、邊緣清晰，核圓居中；氟中毒組大鼠海馬區神經細胞腫脹、空泡化，部分細胞核濃染、固縮，頂樹突排列紊亂(圖2g,h)。

2.6 電鏡下各組織的病理學改變

電鏡下可見，對照組成骨細胞核形狀完整、核仁明顯，胞質內含大量細胞器，線粒體結構清晰，內質網豐富；氟中毒組大鼠的成骨細胞胞漿成分減少，輕度核固縮、呈不規則型、核仁消失，染色質濃聚邊集，多數線粒體發生腫脹，部分呈現空泡化(圖3 a,b)。對照組大鼠肝細胞結構完整、形態規則，細胞界限清晰，細胞核圓且位置居中，細胞質內細胞器豐富，線粒體呈橢圓形，線粒體嵴連續清晰；氟中毒組大鼠肝細胞變形，細胞界限不清，染色質濃縮邊集，在核膜下成新月形改變，細胞內廣泛線粒體明顯腫脹，嵴斷裂或消失，內質網擴張(圖3 c,d)。對照組大鼠腎近曲小管上皮細胞核圓，位于中心，細胞周圍排列細長而密集的微絨毛，線粒體豐富、嵴膜清晰、內質網發達；氟中毒組大鼠細胞腫脹，線粒體普遍腫大，線粒體嵴減少或消失，成空泡狀，個別線粒體膜破裂，細胞核染色質邊集，核膜褶皺，并出現斷裂(圖3 e,f)。對照組大鼠腦神經元細胞核大而圓，細胞核膜的雙層結構較為清晰，核內染色質分布均勻，胞漿中細胞器含量豐富且分布正常；氟中毒組大鼠神經細胞膜褶皺，線粒體變形、嵴消失、空泡形成，染色質固縮、濃染(圖3 g,h)。

表3 各組大鼠組織氟含量Table 3 Changes in tissue fluoride of rats in each group

注：與對照組比較，**P<0.01。

Note. Compared with the control group，**P<0.01.

表4 各組大鼠不同組織中MDA含量Table 4 MDA content in different tissues of the rats in each group

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group，*P<0.05，**P<0.01.

注：對照組：a，股骨；c，肝臟；e，腎臟；g，腦海馬區。氟中毒組：b，股骨；d，肝臟；f，腎臟；h，腦海馬區。圖2 實驗大鼠各組織病理學改變Note. Control group: a, femur; c, liver; e, kidney; g, hippocampus. Fluorosis group: b, femur; d, liver; f, kidney; h, hippocampus.Figure 2 Histopathological changes in different tissues of the rats in each group

注：對照組：a，成骨細胞；c，肝細胞；e，腎臟近曲小管上皮細胞；g，腦神經元。氟中毒組：b，成骨細胞；d，肝細胞；f，腎臟近曲小管上皮細胞；h，腦神經元。圖3 實驗大鼠各組織細胞超微結構Note. Control group: a, osteoblast; c, hepatocyte; e, epithelial cells of proximal convoluted tubules; g, cerebral neuron. Fluorosis group: b,osteoblast; d, hepatocyte; f, epithelial cells of proximal convoluted tubules; h, cerebral neuron.Figure 3 Ultrastructural changes of different organ tissues in the rats

3 討論

氟化物在自然環境中廣泛存在，可通過經口攝入、皮膚接觸及呼吸吸入等多種途徑進入機體[9]。絕大部分經口攝入的氟化物可由消化系統迅速吸收入血，最終以離子狀態分布全身[10-11]，主要集中在骨骼和牙齒，其余部分可在肝、腦、腎等軟組織中蓄積[11-13]，當含量達到一定程度即可引起相應組織病理學改變，導致氟中毒。地方性氟中毒在我國分布廣泛，飲水型氟中毒是其主要形式之一，考慮到相似的攝入途徑，結合相關研究結果[1,9-11]，本實驗通過給予大鼠飲用含氟量較高的自來水制備氟中毒大鼠模型，結果發現，氟中毒大鼠出現不同程度的氟斑牙，且骨、肝、腎及腦組織中氟含量均顯著增加，說明氟中毒模型制備成功，此外，氟中毒大鼠還伴有組織MDA水平增高，及光鏡下顯著的病理學改變，可見，高氟攝入已引起實驗大鼠組織病理性損傷。

氟對骨組織的損傷呈多種病理狀態[17-18]，通常，氟在低劑量條件下可激活成骨細胞，促進成骨作用，而高劑量條件下則抑制成骨過程。本次實驗觀察到，氟中毒大鼠骨小梁呈現粗細不均、間距增大和部分斷裂等骨質疏松樣改變，這與鄭冬冬等[19]的研究結果相似；作為機體的主要代謝器官，肝和腎在氟性細胞損傷作用中首當其沖，動物實驗均已證實，過量氟攝入可導致肝腎組織的結構和功能異常[1]；此外，氟亦可穿過血腦屏障進入腦組織，對神經元產生毒性作用，進而影響腦功能，干擾正常的記憶和思維能力[20]，本實驗中，氟中毒大鼠海馬神經細胞出現的細胞腫脹、空泡化等形態學變化，可為腦功能異常提供病理學解釋。

近些年，多數研究認為[21-22]，氧化應激主導了氟中毒狀態下機體的損傷作用，而組織細胞氧化損傷時又多伴有細胞凋亡的典型特征，如細胞核染色質邊集、線粒體腫脹等。在此過程中，作為脂質過氧化的終產物，MDA常用作反映組織細胞氧化損傷程度的首選指標[23]。結合本次研究結果，氟中毒組大鼠血清及各組織中MDA水平明顯升高，這就提示氟中毒大鼠正處于相對嚴重的氧化應激狀態。而這種氧化應激狀況的產生，可能涉及下列因素[24-26]：①氟能與某些抗氧化酶中的金屬元素形成復合物，該抗氧化酶的活性部分喪失；②氟化物在生物代謝中可形成部分有機氟，去烷基后便可形成氟自由基；③過量的氟通過激活膜結合酶，催化原子氧，導致抗氧化酶消耗量劇增；④電負性極強的氟元素，可以直接攻擊氧，細胞氧代謝紊亂，自由基產生。因此，學者們普遍認為氧化應激是氟中毒所致的細胞凋亡的機制之一。本研究電鏡結果顯示，氟中毒大鼠的成骨細胞、肝細胞、腎近曲小管上皮細胞及腦神經元均呈現細胞凋亡的典型形態特征，如細胞核固縮、核仁消失，染色質濃集，線粒體腫脹、空泡化等，這也印證了上述觀點。只是，氟對機體的損傷機制錯綜復雜，而氟性氧化損傷作用在其中占有多大比重，亟待進一步研究探討。

總之，氟化鈉可引起實驗性大鼠骨、肝、腎及腦組織病理性損傷，導致細胞凋亡。