江西亞洲柑橘木虱的種群遺傳結構研究

羅育發 吳凱 付丹

摘要 亞洲柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama是蕓香科Rutaceae植物新梢期的重要害蟲，也是黃龍病Huanglongbing的主要傳播媒介，嚴重威脅江西柑橘產業的發展。本文利用線粒體基因標記，研究江西10個地點亞洲柑橘木虱的種群遺傳結構和多態性。擴增了2個線粒體COⅠ基因片段，長度為1 431 bp。其中多態性位點2個（均為非同義突變，A/G轉換），單倍型3個（Hap1，Hap2和Hap3）。最常見的單倍型是Hap1（占總樣本數的91.7%），發生在所有采樣點;其次為Hap3（6.3%），分布在大余和崇義;Hap2（2.0%）僅在興國出現。單一直線型的單倍型網絡結構模式、小而不顯著的HR（Harpendings raggedness）指數值，以及單峰型錯配分布曲線均表明：江西地區的亞洲柑橘木虱是近期入侵并經歷了快速的種群動態擴張。

關鍵詞 亞洲柑橘木虱; 柑橘黃龍病; 種群遺傳結構; COⅠ基因; 江西

中圖分類號： S 433.3

文獻標識碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018234

Abstract The Asian citrus psyllid Diaphorina citri Kuwayama （Hemiptera： Liviidae）， an important pest of the young developing leaves of Rutaceae， is the main vector of the bacterium that causes citrus greening disease （huanglongbing）. The population genetic structure and polymorphism of D.citri from 10 sites in Jiangxi were studied by using mitochondrial markers. Two fragments of mitochondrial COⅠ sequences were amplified with a total length of 1 431 bp. We found 2 polymorphic sites （nonsynonymous， A/G transition） and 3 haplotypes （Hap1，Hap2 and Hap3）. Among these， the most common haplotype was Hap1 （91.7% of the total） occurring at all sampling sites. Hap3 （6.3%） was distributed in Dayu and Chongyi. Hap2 （2%） was observed only in Xingguo. The singleline haplotype network model， the small and insignificant Harpendings raggedness （HR） index and the unimodal mismatch distribution curve indicated that D.citri populations in Jiangxi had the recent invasion and rapid dynamic expansion.

Key words Diaphorina citri; huanglongbing; population genetic structure; COⅠ gene; Jiangxi

亞洲柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama（半翅目Hemiptera，扁木虱科Liviidae）是熱帶和亞熱帶地區柑橘的主要害蟲，其成蟲主要以嫩葉及未成熟莖的韌皮部為食，有時也會吸食寄主植物的老葉[12]。它能夠傳播韌皮部桿菌屬的病原體Candidatus Liberibacter spp.，導致柑橘黃龍病huanglongbing，后者被認為是柑橘上最嚴重的病害之一[3]。亞洲柑橘木虱最早于1907年在我國臺灣發現[4]，現已廣泛分布于整個亞洲、中東地區、美國南部、加勒比群島以及南美洲各地[57]。該蟲自20世紀初入侵我國后，已在廣西、廣東、福建、江西等地區嚴重發生[8]，并逐步入侵到我國長江以南各省（區），目前隨全球氣候變暖，正繼續向北方擴散。亞洲柑橘木虱的入侵促進了柑橘黃龍病在江西省的擴散蔓延，給該地區的柑橘產業造成巨大損失。

遺傳結構是指等位基因或基因型在時間或空間上的非隨機分布。研究種群的遺傳結構可以估計種群的遺傳多樣性和種群間的基因交流，推斷祖先種群和種群的遺傳分化水平。這些信息對于害蟲的綜合管理至關重要。目前國內對亞洲柑橘木虱的研究主要側重于它的宏觀生物學及生態學特性，如生活史、耐熱性、耐寒性、傳菌性，以及光、溫濕度等對其發育繁殖與存活的影響;對其田間種群的發生和防控等方面也有詳細報道[1]。然而，迄今為止對該害蟲種群遺傳學等微觀方面缺乏研究。

不同地區的溫度、濕度、寄主植物和人類活動等環境因子對亞洲柑橘木虱的存活和繁殖有顯著影響[912]。亞洲柑橘木虱的高繁殖量和短繁殖周期（2～7周），使其在入侵后對新環境有迅速的反應。入侵種群將獲得不同的生態學特性，例如在寄主偏好、求偶行為、發育時間、致病性、對天敵和農藥的敏感性，以及耐熱性等方面發生改變[1316]，并分化形成不同的地理種群。目前國外學者在探討局部地區亞洲柑橘木虱的種群遺傳結構及其分化等方面已取得許多重要的研究成果[1720]。

線粒體COⅠ基因包含豐富的遺傳信息，進化速率適中，可作為種屬系統進化研究的良好標記[2122]。為了了解江西亞洲柑橘木虱的種群遺傳結構，筆者測定了該地區不同地理種群的COⅠ基因片段序列，分析其種群遺傳多樣性及地理分化，為江西亞洲柑橘木虱及黃龍病的防控提供重要參考資料。

1 材料與方法

1.1 樣本收集、測序和序列分析

從江西瑞金（25.796°N，115.969°E）、龍南（24.901°N，114.769°E）、石城（26.427°N，116.278°E）、興國（26.275°N，115.343°E）、崇義A（25.552°N，114.281°E）、崇義B（25.612°N，114.289°E）、尋烏（24.961°N，115.661°E）、大余A（25.447°N，114.452°E）、大余B（25.442°N，114.446°E）和章貢（25.799°N，114.889°E）等10個取樣點，采集到48頭亞洲柑橘木虱成蟲，放入95%乙醇并保存在-20℃冰箱中，用于測序和種群遺傳學分析。采用試劑盒TIANamp Micro DNA Kit（TIANGEN Biotech Co.， Ltd）提取單個樣本的總基因組DNA，具體操作步驟見說明書。采用2對引物擴增COⅠ基因片段序列（表1）。反應體系選用寶生物工程 （大連） 有限公司的試劑盒： 1 μL的10 mmol/L dNTPs，1.5 μL的15 μmol/L引物，4 μL的25 mmol/L MgCl2，5 μL的10×Buffer，0.6 μL的5U TaqDNA聚合酶，1 μL的20 ng/μL的基因組DNA模板，ddH2O補齊反應總體積到50 μL。PCR反應在Eppendorf Mastercycler pro S梯度PCR儀上進行。反應條件：94℃預變性5 min;之后進入循環，94℃變性30 s，45～56℃退火45 s;72℃延伸1 min，共運行40個循環;最后72℃延伸3 min。所有PCR產物直接送到上海生工生物工程有限公司進行純化和測序，測序引物見表1。

用SEQUENCHER ver. 4.1.2（Gene Codes Corporation， Ann Arbor， MI）和BioEdit[23]軟件核查和編輯DNA序列。所有序列都用CLUSTALW和 MAFFT ver.5[24]軟件進行比對。應用DnaSP ver.5.10軟件[25]獲取序列單倍型和多態性位點。所有序列上傳至GenBank（登錄號：MK804797～MK804890）。

1.2 單倍型網絡重構及種群歷史動態分析

為了比較江西不同地理種群之間的遺傳學關系，本文利用PopART （http：∥popart.otago.ac.nz）軟件構建亞洲柑橘木虱COⅠ序列的單倍型網絡結構模式。為了推算其種群動態歷史，我們利用Arlequin ver. 3.5軟件中的錯配分布分析檢驗該害蟲種群在江西地區是否經歷近期的擴張事件。錯配分布是以可視化方式體現群體歷史動態的方法。一般來說，動態平衡的種群錯配分布分析呈現多個峰形，而經歷近期擴張的種群錯配分布分析呈現單個峰形[26]。

2 結果與分析

2.1 單倍型和遺傳變異

從10個采集點的48頭亞洲柑橘木虱中擴增到2個線粒體COⅠ基因片段（COⅠ1和COⅠ2，長度分別為760 bp和671 bp），總長度為1 431 bp。分析所有序列時發現2個多態性位點（均為非同義突變，A/G轉換）和3個單倍型（Hap1，Hap2和Hap3，表2）。其中Hap1最常見（占總樣本數的91.7%），入侵所有采集點;其次為Hap3（占6.3%），分布在大余A和B以及崇義A;Hap2（占2%）僅在興國出現（表3）。

2.2 種群遺傳關系

江西亞洲柑橘木虱的單倍型網絡結構為單一直線型模式（圖1）。Hap1均衡地分布在所有采集區域，為祖先單倍型;出現在興國的單倍型Hap2是由祖先單倍型Hap1經一次突變形成;來自大余和崇義的單倍型Hap3則由Hap2經一次突變產生。

2.3 種群動態歷史

錯配分布分析結果見圖2。單峰型分布模式，以及小而不顯著的HR（Harpendings raggedness）指數值（P>0.05）（圖2）表明：亞洲柑橘木虱種群在近期入侵江西，并經歷迅速的動態擴張[26]或因相鄰地區間存在高的種群遷移水平而形成區域擴張[2728]。最低的核苷酸突變（如0和1）發生頻率高（圖2）同樣暗示：該地區的亞洲柑橘木虱種群是由少數祖先個體通過近期擴張形成。單倍型網絡結構模式（圖1）也證實該害蟲在入侵江西后經歷快速的種群擴散過程。

3 討論

江西省是我國重要的柑橘產地，生產的臍橙、蜜橘、柚類享譽海內外。20世紀70年代末，亞洲柑橘木虱入侵贛州地區，進而引發黃龍病[29]。此后由于該省柑橘栽培區冬季氣溫轉暖，木虱種群變大，其地理分布明顯北移，發生范圍進一步擴大。本研究擴增了江西10個地點亞洲柑橘木虱的2個線粒體COⅠ基因序列片段，總長度達到1 431 bp，但分析所有序列后僅發現2個多態性位點，且都為非同義突變類型（A/G轉換）。這種低的遺傳變異現象說明該害蟲在江西地區經歷了最近的入侵事件，并且可能是單個單倍型的入侵。其3個單倍型（Hap1，Hap2和Hap3）在不同地區出現的頻率不同。在瑞金、龍南、石城、尋烏和章貢只發現一個單倍型（Hap1），可能意味著這些種群在入侵后由于繁殖體數目小和瓶頸效應，它們還在繼續維持這個祖先單倍型。而興國除了具有祖先單倍型外，由于少數個體發生點突變，形成一個新的單倍型（Hap2）;崇義和大余在該突變之后再次發生點突變，又增加了一個單倍型（Hap3），因而這些地區的柑橘木虱顯示出相對較高的遺傳多態性。這可能是由于多次入侵和/或在一個相對較長的擴張歷史過程中，由于棲息地環境的改變（如柑橘種植地大量使用殺蟲劑或地區性氣候劇烈變化等）導致基因發生突變。目前在伊朗、巴基斯坦、巴西、美國等地也有關于亞洲柑橘木虱遺傳多樣性的報道[1620]，且使用與本文相同的分子標記（COⅠ1），但采樣區域、所分析樣本的數量，以及COⅠ序列片段的長度不同。本文增加了一個用于遺傳結構分析的COⅠ基因片段（COⅠ2），從而獲得了更多的序列變異信息。在本研究中，亞洲柑橘木虱的單倍型網絡關系及錯配分布分析結果都表明，該害蟲在近期入侵江西地區，并且經歷了快速的種群動態擴張。然而我們并不清楚江西亞洲柑橘木虱的來源及與全國其他省份有著怎樣的遺傳學關系;對全國各地入侵種群的遺傳變異規律和分化格局等還有待深入研究。

參考文獻

[1] YANG Y， HUANG M， BEATTIE G A C， et al. Distribution， biology， ecology and control of the psyllid Diaphorina citri Kuwayama， a major pest of citrus： A status report for China [J]. International Journal of Pest Management， 2006， 52： 343352.

[2] 鄧明學.以控制木虱為重點的柑桔黃龍病綜合防治理論的形成過程、依據和技術要點[J].中國農學通報，2009，25（23）：358363.

[3] DA GRAA J V. Biology， history， and world status of Huanglongbing [C]∥Taller International sobre Huanglongbing de los cítricos （Candidatus Liberibacter spp.） yel psílido asiático de los cítricos （Diaphorina citri）， 7-9 May 2008， Hermosillo， Sonora， Mexico.

[4] HALBERT S E， MANJUNATH K L. Asian citrus psyllids （Sternorrhyncha： Psyllidae） and greening disease of citrus： a literature review and assessment of risk in Florida [J]. Florida Entomologist， 2004， 87： 330353.

[5] HOLLIS D. A new citrusfeeding psyllid from the Comoro Islands， with a review of the Diaphorina amoena species group （Homoptera）[J]. Systematic Entomology， 1987， 12： 4761.

[6] WATERHOUSE D F. Biological control of insect pests： Southeast Asian prospects [M].ACIAR Monograph Series No. 51. Canberra： Australian Centre for International Agricultural Research. 1998.

[7] HALBERT S E， NU'EZ C A. Distribution of the Asian citrus psyllid Diaphorina citri Kuwayama （Rhynchota： Psyllidae） in the Caribbean basin [J]. Florida Entomologist， 2004， 87： 401402.

[8] LUO Y F， AGNARSSON I. Global mtDNA genetic structure and hypothesized invasion history of a major pest of citrus， Diaphorina citri （Hemiptera： Liviidae）[J]. Ecology and Evolution， 2018， 8： 257265.

[9] ZHAO X. Occurrence of citrus yellow shoot （greening） disease in Guangxi and southern Sichuan： a brief review[C]∥The FAOUNDP Project Coordinator in Fuzhou. Regional workshop on citrus greening huanglongbing disease， 6-12 December 1987， Fuzhou， China.

[10]YANG Y. Effects on light， temperature and humidity on the development， reproduction and survival of citrus psylla[J]. Acta Ecologica Sinica， 1989， 9： 348354.

[11]XU C， XIA Y， KE C. Study on the biology and control of citrus psylla [J]. Acta Phytophylacica Sinica， 1994， 21： 5356.

[12]WANG Z. Distribution and transmission of citrus psylla in Guizhou Province [J]. Tillage and Cultivation， 2002， 22（4）： 6263.

[13]CARMICHAEL L E， KRIZAN J， NAGY J A， et al. Historical and ecological determinants of genetic structure in arctic canids [J]. Molecular Ecology， 2007， 16： 34663483.

[14]PINHO C， HARRIS D J， FERRAND N. Comparing patterns of nuclear and mitochondrial divergence in a cryptic species complex： the case of Iberian and North African wall lizards （Podarcis， Lacertidae）[J]. Botanical Journal of the Linnean Society， 2007， 91： 121133.