適用于雙向電泳分析的鏈格孢菌體蛋白提取方法的篩選

李貞彪 王軍節 王鵬

摘要 為篩選出一套適用于雙向電泳分析的鏈格孢菌蛋白的提取方法，以該菌為研究材料，首先采用TCA丙酮法、磷酸TCA丙酮法、SDS提取法和TCA/丙酮SDS/酚抽提法分別提取菌絲蛋白質，然后進行蛋白質濃度的測定和單向SDSPAGE試驗，并建立雙向電泳體系。結果表明：TCA/丙酮SDS/酚抽提法所獲得的蛋白質濃度為15.9 mg/mL，分別是其他三種方法所得蛋白濃度的2.64、4.61和1.43倍;SDSPAGE圖譜中形成的條帶數目最多、豐度最好;所獲得的2DE圖譜背景清晰干凈，無明顯的橫縱條紋，分辨率高，可辨別的蛋白質點數為1 138個，是TCA丙酮法所分離蛋白點數的1.89倍。由此可知，TCA/丙酮SDS/酚抽提法為鏈格孢菌蛋白提取的最優方法，該方法所提取的蛋白質適用于雙向電泳分析及后續的蛋白質組學研究。

關鍵詞 鏈格孢; 采后病害; 蛋白質提取; 雙向電泳; TCA/丙酮SDS/酚抽提法

中圖分類號： S 432.1

文獻標識碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018285

Abstract In order to screen the extraction methods of total protein from Alternaria alternata suitable for twodimensional electrophoresis analysis， the mycelia proteins in the pathogen were extracted by four methods of TCAacetone， phosphateTCAacetone， SDS and TCA/acetoneSDS/phenol， respectively. Furthermore， the protein concentration was analyzed and the separation effect of total protein was detected by SDSPAGE.In addition， a suitable 2D gel electrophoresis system for mycelia protein was established. The results showed that the protein concentration extracted by the method of TCA/acetoneSDS/phenol reached 15.9 mg/mL， which was 2.64， 4.61 and 1.43 times of that extracted by the methods of TCAacetone， phosphateTCAacetone and SDS， respectively. Moreover， the most and clearest protein strips in SDSPAGE gel were obtained by TCA/acetoneSDS/phenol extraction method， and the 2DE map with a distinct background， high resolution， without obvious horizontal and vertical stripes were also obtained. The number of protein points reached 1 138， which is 1.89 times of that isolated by the TCAacetone method. It is suggested that the TCA/acetoneSDS/phenol extraction method is the best extraction method of mycelia protein from Alternaria alternata. Meanwhile， the protein extracted by the method is suitable for twodimensional electrophoresis analysis and subsequent proteomic research.

Key words Alternaria alternata; postharvest disease; protein extraction; twodimensional electrophoresis; TCA/acetoneSDS/phenol method

鏈格孢Alternaria alternata是一種能侵染多種農作物和經濟作物的重要植物病原真菌，廣泛分布在土壤、空氣和農作物殘體中，可寄生、腐生和兼性寄生或腐生[1]。A.alternata是半知菌亞門鏈格孢屬的模式種[2]，其菌落邊緣整齊，初白色，而后逐漸變為不同程度的褐色，氣生菌絲呈短絨狀，其分生孢子梗為深色，單枝，頂端單生或串生分生孢子，分生孢子呈黑褐色，形狀大小不一，呈倒棍棒狀或倒梨形，有橫隔膜[3]。該菌可侵染蘋果[4]、梨[5]、草莓[6]、柑橘[7]、枸杞[89]、甜瓜[10]、番茄[11]等多種果蔬，引起采后爛損，并且其侵染過程產生的交鏈孢霉毒素給果蔬及其制品銷售帶來食品安全隱患[12]。全面解析病菌的分子致病機理對制定該病害的有效控制策略有重要意義。目前，已有研究人員對該病菌分子致病機理開展了較為廣泛的研究，但研究主要集中在毒素[13]和代謝產物[1415]上，從蛋白質水平揭示鏈格孢分子致病機理的研究尚未見報道。

近年來，蛋白質組技術已經廣泛應用于植物病原真菌致病機理的研究中。雙向電泳（twodimensional gel electrophoresis， 2DE）技術是蛋白質組學研究中一種有效的蛋白質分離方法，而獲得高分辨率2DE圖譜的關鍵步驟是蛋白質提取[16]。目前，適用于2DE技術的植物病原真菌總蛋白提取常用TCA/丙酮法[17]、酚抽提法[18]及其衍生的改良方法。江珊等[19]采用改進的TCA/丙酮法對稻瘟病菌Magnaporthe oryzae菌絲體蛋白質進行雙向電泳分析，獲得了高分辨率電泳圖譜，較改進前TCA/丙酮法蛋白質點數量平均提高687個點。FernándezAcero等[20]研究了磷酸鹽緩沖液預處理對TCA丙酮法提取灰葡萄孢Botrytis cinerea菌絲體總蛋白的效果，發現在TCA/丙酮沉淀蛋白質樣品之前使用磷酸鹽緩沖液進行預處理可顯著提高灰葡萄孢菌絲體總蛋白的提取效果。González等[21]研究發現TCA/丙酮結合苯酚提取法所提取的灰葡萄孢菌絲體蛋白含量高于磷酸TCA丙酮法，且該方法提高了蛋白點的分辨率，減少了拖尾，有更多的蛋白點被檢測出。舒燦偉等[22]對采用不同蛋白提取方法所提取的水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani蛋白質樣品質量進行比較研究，結果表明，優化的TCA/丙酮酚/SDS聯合抽提法適用于進行雙向電泳的水稻紋枯病菌蛋白質的提取。但目前有關鏈格孢中蛋白質的有效提取方法研究鮮有報道。

本研究采用TCA丙酮、磷酸TCA丙酮、SDS提取和TCA/丙酮SDS/酚聯合抽提等方法提取鏈格孢總蛋白，從蛋白質濃度和電泳分辨率等方面比較了不同提取方法的提取效果，對較理想的兩種方法進行雙向電泳對比分析，旨在探索優化出一套適合雙向電泳分析的鏈格孢總蛋白的提取方法，為相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

鏈格孢Alternaria alternata由本實驗室分離自黑霉病發病枸杞果實。

1.1.2 主要試劑和儀器

丙烯酰胺、N，N甲叉雙丙烯酰胺、Tris、二硫蘇糖醇（DTT）、溴酚藍、過硫酸銨（Ap）、甘氨酸、尿素、硫脲、碘乙酰胺（IAA）、四甲基乙二胺（TEMED）、考馬斯亮藍R250購自Amresco公司;IPG膠條（pH 3～10，17 cm，非線性）、兩性電解質BioLyte（pH 3～7）、礦物油為BioRad公司產品;其他試劑均為國產分析純。

IEF等電聚焦電泳儀、雙向垂直板電泳儀、制冷水浴循環器、UV凝膠成像系統、GS800 Calibrated Imaging Densitometer型彩色掃描儀，為BioRad公司產品;低溫高速離心機為長沙湘儀離心機儀器有限公司生產;紫外可見分光光度計為上海元析儀器有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 病原菌培養與收集

參照趙明治等[23]的方法并略作修改。將鏈格孢接種于PDA平板上，于28℃培養箱中培養7 d后，用5 mm直徑的無菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅，取3～5個菌餅接入裝有100 mL PDB的250 mL三角瓶中，置于28℃、170 r/min下恒溫振蕩培養3 d，收集菌絲，超純水洗滌3次，用真空抽濾器將培養的菌絲體抽濾成干燥的菌餅后立刻用液氮冷凍于-80℃保存，備用。

1.2.2 菌體蛋白的提取

分別采用TCA丙酮法、磷酸TCA丙酮法、SDS提取法和TCA/丙酮SDS/酚聯合抽提法提取菌絲蛋白，操作流程見圖1。

TCA丙酮法參照Damerval 等[24]的方法，略作修改。取2 g干燥的菌絲置于研缽中，加液氮研磨至細粉，轉入50 mL離心管中。加入30 mL預冷的質量分數為10% TCA丙酮溶液（含體積分數0.07%的巰基乙醇），渦旋振蕩混勻，-20℃過夜沉淀蛋白質。4℃、12 000 r/min離心20 min，棄上清;再加入含體積分數0.07%巰基乙醇的預冷丙酮，充分混勻，-20℃靜置1 h;重復離心洗滌沉淀3次以去除殘留的TCA;室溫下，將沉淀置于通風櫥內，使蛋白質沉淀中殘留的丙酮揮發干凈;收集干燥后的蛋白質干粉，于-20℃下保存。

磷酸TCA丙酮法參照FernándezAcero等[20]和張小泉[25]的方法，略作修改。將2 g干燥的菌絲液氮研磨至細粉后轉入50 mL離心管，加入30 mL預冷的10 mmol/L磷酸鉀磷酸緩沖液（pH 7.4，含體積分數0.07%的巰基乙醇），渦旋振蕩混勻，-20℃下靜置2 h;4℃、12 000 r/min離心20 min，棄上清;將得到的沉淀重懸于預冷的質量分數為10% TCA丙酮溶液（含0.07%的巰基乙醇）中，渦旋振蕩混勻，-20℃過夜沉淀蛋白質;4℃、12 000 r/min離心20 min，棄上清;加入含體積分數0.07%巰基乙醇的預冷丙酮，充分混勻，重復洗滌3次。室溫下，待丙酮揮發干凈后收集干燥的蛋白質干粉，于-20℃下保存。

SDS提取法參照舒燦偉等[22]的方法，略作修改。如前所述，將2 g干燥的菌絲研磨成細粉后轉入50 mL離心管，立刻加入30 mL預冷的SDS緩沖液（含30%甘油、4% SDS、5%巰基乙醇、0.1 mol/L，pH 6.8 TrisHCI），渦旋振蕩混勻;在80℃下恒溫水浴5 min;隨后4℃、12 000 r/min離心20 min，棄沉淀;將所得的上清液加入含體積分數0.07% 巰基乙醇的預冷丙酮，渦旋振蕩混勻，-20℃過夜。4℃、12 000 r/min離心20 min，棄上清，獲得的沉淀再用預冷丙酮洗滌1次。室溫下，待丙酮揮發干凈后收集干燥的蛋白質干粉，于-20℃下保存。

TCA/丙酮SDS/酚聯合抽提法參照舒燦偉等[22]和Wang等[26]的方法，略作修改。如前所述，將2 g干燥的菌絲研磨成細粉后轉入50 mL離心管，立刻加入30 mL預冷的質量分數為10% TCA丙酮溶液（含體積分數0.07%的巰基乙醇），渦旋振蕩混勻，-20℃ 過夜沉淀蛋白質。4℃、12 000 r/min離心20 min，棄上清;再分別用體積分數80%甲醇溶液（含100 mmol/L醋酸銨）和體積分數80%丙酮溶液各洗滌1次，沉淀通風干燥10 min。向所得沉淀中同時加入5 mL水飽和酚和5 mL SDS緩沖液（水飽和酚與SDS緩沖液1∶1混合），振蕩混勻，室溫靜置5 min;離心，吸取上層酚相轉移至新的50 mL離心管中，再加入5倍體積預冷的100 mmol/L醋酸銨甲醇溶液，-20℃ 過夜沉淀。4℃、12 000 r/min離心20 min，棄上清;沉淀用上述甲醇和丙酮溶液再各洗滌1次，收集干燥后的蛋白質干粉，于-20℃下保存。

1.2.3 蛋白質溶解

分別稱取上述4種方法獲得的蛋白質樣品干粉50 mg加入1 000 μL裂解液（8 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，4% W/V CHAPS，1% W/V DTT，0.2% V/V BioLyte pH 3～10）中，渦旋混勻后室溫放置3～4 h，每30 min輕輕搖勻1次，然后在4℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液，將樣品分裝后于-80℃下保存或直接用于電泳。

1.2.4 蛋白質定量

制備的蛋白樣品均參照 Bradford 法[27]測定蛋白質的含量。以牛血清白蛋白（BSA）作為標準蛋白，在595 nm下測定不同濃度標準液的吸光度制作標準曲線，標準方程為y=0.007 9x+0.015 9，R2=0.997 8，然后根據樣品的吸光度、稀釋倍數計算出不同提取方法獲得的蛋白質濃度，結果分別用mg/mL表示。

1.2.5 SDSPAGE分析

采用等體積上樣的方法，將裂解后的蛋白質樣品與2× SDSPAGE上樣緩沖液按1∶1的體積比充分混合，100℃下沸水浴 3～5 min，將各方法所得到的蛋白樣品調整至同一濃度后移取10 μL樣品混合液進行上樣，開始時用80 V電泳至濃縮膠部分成一水平線后，提高電壓到120 V電泳至溴酚藍到達距膠底1 cm處時停止電泳，電泳結束后將凝膠轉移至盛有20 mL考馬斯亮藍R250染色液的容器內，在水平搖床上緩慢振蕩1 h，使凝膠顏色與染色液顏色一致為止。染色完畢后，將凝膠轉移至含有適量脫色液的容器內，水平搖床緩慢振蕩4～8 h至條帶清晰為止。

1.2.6 雙向電泳分析

雙向電泳試驗參照張小泉[25]的方法，略作修改。蛋白樣品與水化液（8 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲、4% W/V CHAPS，65 mmol/L DTT，0.2% V/V BioLyte pH 3～10，0.001%溴酚藍）充分混合，蛋白質上樣量為400 μg/泳道，上樣總體積350 μL，選用IPG膠條（17 cm、pH 3～10、非線性）。等電聚焦程序設置為：20℃，50 V水化12 h;除鹽：250 V線性0.5 h，500 V快速0.5 h，750 V快速1 h，1 000 V快速1 h;升壓：5 000 V線性2 h，10 000 V線性3 h;聚焦： 10 000 V快速60 000 Vh;保持：500 V快速，任意時間。聚焦結束后，膠條依次在含有 2% DTT的平衡緩沖液（0.375 mol/L TrisHCl pH 8.8，6 mol/L尿素，20%甘油，2% SDS）和含有2.5%碘乙酰胺的平衡緩沖液中進行平衡，每次平衡15 min。采用12%的分離膠進行SDSPAGE，電泳參數設置為50 V/gel、1.5 h，200 V/gel、8 h，待溴酚藍指示劑到達距底部邊緣1 cm處時即可停止電泳。

1.2.7 凝膠染色與圖像處理

電泳結束后，先將凝膠用超純水漂洗3次，再轉入考馬斯亮藍染色液中，置于水平搖床上，室溫下緩慢染色10 h（或過夜）左右。再將凝膠轉入脫色液I（甲醇∶水∶冰乙酸=45∶45∶10）中，水平搖床上緩慢脫色1 h，再轉入脫色液Ⅱ（乙醇∶水∶冰乙酸=45∶45∶10）中緩慢脫色4～8 h，期間更換脫色液Ⅱ 2～3次，直到藍色背景消失。染色后的凝膠采用BIORAD GS800 Calibrated Imaging Densitometer型彩色掃描儀掃描，并用Quantity one軟件獲取圖片。掃描后的凝膠圖像用PDQuest 8.0.1軟件進行圖譜分析。

1.2.8 數據處理與分析

所有試驗數據采用Excel 2016、IBM SPSS 21.0軟件統計分析與作圖分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白質提取效果的比較

不同提取方法均能獲得菌絲蛋白，且獲得蛋白的濃度差異顯著。由表1可知，磷酸TCA丙酮法獲得蛋白質濃度最低，為3.447 mg/mL，TCA丙酮法和SDS提取法提取蛋白濃度較高，分別為6.027 mg/mL和11.124 mg/mL，而獲得最高蛋白質濃度方法為TCA/丙酮SDS/酚聯合抽提法，為15.900 mg/mL，分別是TCA丙酮法、磷酸TCA丙酮法和SDS提取法的2.64、4.61和1.43倍。

2.2 SDSPAGE電泳效果分析

從這4種提取方法所制備的菌絲蛋白的SDSPAGE電泳圖譜（圖2）可以看出，4種方法提取的菌絲蛋白的樣品顏色、條帶數目、清晰程度都存在較大差異。采用TCA丙酮法獲得的蛋白質粉末呈現淺灰色，含有少量色素雜質，蛋白提取率較高，條帶較清晰，約有25條;相比于TCA丙酮法，磷酸TCA丙酮法所獲得的蛋白質粉末呈深灰色，含色素雜質較多，蛋白提取率不高，條帶相對較淺，尤其是分子量較大的蛋白質豐度較差，約有26條;SDS提取法所獲得的蛋白質為白色粉末，條帶背景較模糊，條帶數約為27條，高分子量蛋白質條帶微弱，而低分子量蛋白質條帶顏色較深，且背景十分模糊。而TCA/丙酮SDS/酚抽提法相比其他3種方法所獲得的蛋白條帶數目更多、更清晰，尤其是高分子量蛋白質條帶，總共約有28條。因此，從SDSPAGE電泳的比較結果可以初步篩選出TCA丙酮法和TCA/丙酮SDS/酚抽提法更適合于進一步進行雙向電泳檢測。

2.3 兩種方法提取蛋白的雙向電泳比較

通過SDSPAGE電泳初步篩選出TCA丙酮法和TCA/丙酮SDS/酚抽提法為較好的提取方法，再在嚴格控制雙向電泳參數和方法相同的條件下，分別對這兩種方法所提取的蛋白質進行雙向電泳檢測，試驗結果如圖3所示。

從圖中可以看出，兩種蛋白提取方法效果有明顯的差異。從蛋白質的分辨率來看，采用TCA/丙酮SDS/酚抽提法所提取蛋白質的雙向電泳圖譜的蛋白質分辨率明顯優于TCA丙酮法的蛋白質樣品圖譜。從雙向電泳圖譜中可分辨點的數目來看，TCA丙酮法所提取的蛋白質樣品較少，2DE圖譜中蛋白點數較少，為603個，且圖譜橫紋較多，分辨率較低（圖3a）。相比而言，TCA/丙酮SDS/酚抽提法所得到的電泳圖譜背景干凈，幾乎沒有明顯的拖尾現象，蛋白點獨立清晰圓潤，分布較均勻，沒有彌散的蛋白質點，且點數明顯多于TCA丙酮法，為1 138個。說明該提取方法獲得的蛋白樣品雜質較少，得到了理想的分離效果。由此表明，TCA/丙酮SDS/酚抽提法所獲得的蛋白質更適合于鏈格孢菌絲蛋白的雙向電泳分析。

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（責任編輯：田 喆）