湘西地區獼猴桃細菌性潰瘍病抗性資源篩選及其抗性機理研究

崔麗紅 高小寧 張迪

摘要 由Pseudomonas syringae pv. actinidiae （Psa）引起的潰瘍病是獼猴桃生產中威脅最大的細菌性病害。種植抗病品種是防治獼猴桃潰瘍病最有效途徑，獼猴桃抗源是抗病育種的物質基礎。本試驗通過離體接種，在室內評價了4個不同種的7個獼猴桃資源及品種對潰瘍病的抗性。結果表明：供試材料離體葉片、枝條接種潰瘍病菌后，其發病時間、病斑大小、發病率差異明顯。按病斑大小排序，其抗性強弱依次為毛花獼猴桃‘M9808>對萼獼猴桃‘S9801>美味獼猴桃‘M06>美味獼猴桃‘米良1號>中華獼猴桃‘Z12>中華獼猴桃‘東紅>中華獼猴桃‘紅陽（CK）。其中，毛花獼猴桃‘M9808抗病性最強，表現為發病最晚，離體葉片、枝條分別于接種后10 d、20 d發病，比對照推遲了8 d、10 d;病斑最小，為對照的1/25、1/11;發病率最低，為對照的1/28、1/10。抗病性相關酶活性比對發現，不同材料的PAL、CAT、POD酶活性差異較大，抗性材料均高于感病材料，且峰值出現時間早于感病材料。其中，毛花獼猴桃‘M9808的PAL峰值最高，接種后5 d出現，比對照早10 d;CAT、POD峰值接種后10 d出現，比對照早5 d。說明毛花獼猴桃‘M9808對潰瘍病抗性最強，可作為今后獼猴桃抗病育種或抗性砧木的理想材料。這為獼猴桃抗病育種提供了理論依據，為獼猴桃潰瘍病的防控提供了參考。

關鍵詞 湘西地區; 獼猴桃細菌性潰瘍病; 抗性資源

中圖分類號： S 435.482.2

文獻標識碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018269

Abstract The bacterial canker caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae（Psa） is the most dangerous disease in the production of kiwifruit. Planting resistant varieties is the most effective way to control kiwifruit canker disease. In this study， we evaluated the resistance of seven kiwifruit resources and varieties by inoculation Psa in detached leaves and shoots. The results showed that the time of lesion appearance， lesion size， and incidence rate were significantly different in the tested materials. The tested kiwifruit resources and varieties were ranked according to the lesions size as follows： Actinidia eriantha ‘M9808>A.valvata ‘S9801>A.chinensis var. deliciosa ‘M06>A.chinensis var. deliciosa ‘Miliang 1>A.chinensis ‘Z12>A.chinensis ‘Donghong>A.chinensis ‘Hongyang（CK）. Among these resource varieties， A.eriantha ‘M9808 had the strongest resistance to Psa. The symptoms occurred on the 10th and 20th day after inoculation in detached leaves and shoot respectively， which was delayed by 8 days and 10 days compared with the CK. The lesions were 1/25 and 1/11 and the incidence rates were 1/28 and 1/10 the CK in detached leaves and shoots， respectively. Meanwhile， its enzyme activities of PAL， CAT， and POD were significantly higher in resistant materials than the susceptible materials. Among these tested materials， the PAL activities were the highest and reached the maximum value at 5 days after inoculation in A.eriantha ‘M9808， 10 days ahead of the CK， and the peak of CAT and POD activities appeared at 10 days after inoculation， 5 days ahead of the CK. Therefore， A.eriantha ‘M9808 can be used as an ideal material for resistance breeding or resistant rootstock of kiwifruit.

Key words Xiangxi area; kiwifruit bacterial canker; resistance resource

獼猴桃細菌性潰瘍病是由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種Pseudomonas syringae pv. actinidiae （Psa）引起的毀滅性病害。自1984年在日本被發現[1]以來，現已有很多國家陸續發現該病，如意大利[2]、法國[3]、新西蘭[4]等。我國1985年首次在湖南東山峰農場發現，3年間就致使該農場栽培的約133.3 hm2獼猴桃果園被毀[5]。此后該病連年發生，全國很多獼猴桃產區感染此病，損失嚴重。2015年湘西永順、鳳凰獼猴桃主栽區 ‘紅陽果園發病率高達95.32%[6]。2016年重慶5個獼猴桃主要生產區中，‘紅陽果園發病最重，有的果園發病率高達100%[7]。2017年四川14個獼猴桃主產區中，潰瘍病發病面積占種植面積的26%[8]。

植物抗病性是植物減輕或抑制病菌侵染的遺傳特性，現代農業中，利用植物抗病性是防治病害的重要措施。Psa是獼猴桃生產中最重要的病害，其危害程度與獼猴桃品種有關。李淼等[9]、申哲等[10]、張慧琴等[11]田間調查發現，不同獼猴桃品種潰瘍病發病程度有明顯差異。林文力等[6]通過隨機抽樣調查發現，湖南鳳凰、永順、吉首獼猴桃園的栽培品種中，‘金魁發病較輕，‘紅陽發病最重。一般植物抗病性有固有和誘導兩種類型，其中植物誘導抗性是因真菌、細菌、病毒等誘導因子侵襲而引起的，可使植物體內POD、PAL、SOD、CAT等抗病性相關酶活性發生一系列變化[12]。李庚飛[13]、李淼[14]、石志軍等[15]、易盼盼[16]研究表明，獼猴桃體內相關酶活性與植株抗病性密切相關，感病品種感病后酶活性顯著低于抗病品種。

湘西是湖南獼猴桃重要的生產基地，截至2014年，種植面積約為1萬hm2，占全省種植面積的90%[17]。近年來，潰瘍病致使當地很多獼猴桃園被毀，損失十分嚴重。為此，筆者特開展湘西地區獼猴桃潰瘍病抗性資源篩選及其抗性機理研究，旨在篩選抗性強的獼猴桃資源，為湘西地區獼猴桃抗病育種提供理論依據，為獼猴桃潰瘍病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料均來自湘西民族職業技術學院試驗園，包括：美味獼猴桃Actinidia chinensis var. deliciosa，品種‘米良1號和育種材料‘M06;中華獼猴桃A.chinensis Planch.，品種‘東紅、‘紅陽（對照）和育種材料‘Z12;對萼獼猴桃A.valvata Dunn，育種材料‘S9801;毛花獼猴桃A.eriantha Benth.，育種材料‘M9808。接種枝條為長勢一致的一年生枝條，直徑0.8 cm;葉片為當年生的健康嫩葉。

接種菌株為P.syringae pv. actinidia str. shaanxiM228（GCA 000344475.2），由西北農林科技大學植物保護學院果樹病害生物學和綜合防治實驗室提供。將致病菌株M228接種至LB固體培養基上，25℃下培養36 h。挑單菌落至LB液體培養基中，于25℃、200 r/min搖床上培養36 h，而后6 500 r/min離心6 min，收集菌體，以備用。

1.2 方法

1.2.1 接種試驗

1.2.1.1 離體葉片接種Psa

參考黃其玲等[18]和Zhao等[19]的方法（略改動），采用真空滲透接種。接種菌液的配制：收集M228菌體，用無菌PBS緩沖液（pH7.0）沖洗M228菌體2～3次，配制OD值為0.2的菌液，再稀釋10-4，取30 mL菌液加入50 mL離心管中待用。將獼猴桃葉片用無菌水沖洗干凈，避開葉脈，用打孔器（d=15 mm）打取葉盤，將葉盤分別放入盛有菌液的離心管中，每管45～50片葉盤，以PBS緩沖液為對照，用真空泵抽真空1 h，取出葉片，吸干葉盤表面水分，將其背面朝下平貼在0.8%水瓊脂的培養皿上，每皿15片，置于L∥D=16 h∥8 h的人工氣候箱中，晝夜溫度16℃/10℃。并分別于接種后2、4、6、8和10 d觀察葉盤發病情況，計算病斑面積/葉盤面積（用F表示）。每皿3次重復。

葉盤發病程度分級：0級，無病斑;1級，F為1%～10%;2級，F為11%～25%;3級，F為26%～50%;4級，F為51%～75%;5級，F為76%～100%。

病情指數=100×Σ（各級葉盤數×相對級值）/（總葉盤數×最高級值）;

抗性評價：病情指數0～10為高抗（HR）;11～25為抗病（R）;26～40為耐病（T）;41～65為感病（S）;65以上為高感（HS）。

1.2.1.2 離體枝條接種Psa

參考Zhao等[19]的致傷接種法（略改動）。接種菌液配制：收集M228菌體，用無菌水制成菌懸浮液，調整OD600至0.2。采集健康的當年生獼猴桃枝條（d=8 mm，長15 cm），用0.6% NaClO表面消毒10 min，滅菌水清洗3～4次，自然晾干，用石蠟將兩端封口。用已滅菌的刀片劃傷樹皮至木質部（寬1 mm）。以無菌水為對照，在傷口處接種M228菌液10 μL，每供試材料接種15根，3次重復。而后放入托盤，置于L∥D=16 h∥8 h，光照和黑暗時溫度分別為16℃和10℃的人工氣候箱中培養。于5、10、15、20和25 d分別測量病斑長度，并用Duncan法進行方差分析。

1.2.2 供試材料接種Psa后相關酶活性測定

1.2.2.1 酶液制備

參照 Given等[20]和孫紅梅等[21]的方法（略有改動）制備離體枝條接種M228后0、5、10、15和20 d的酶液。稱取樣品0.5 g置于研缽中，加入0.05 mol/L PBS緩沖液（pH 7.8） 1 mL和少量PVP，冰浴，研磨成漿，轉至EP管，用3 mL PBS緩沖液沖洗研缽，沖洗液轉入EP管。在4℃、6 500 r/min離心30 min，取上清液（即酶液）。

1.2.2.2 PAL活性測定

參考易盼盼[16]和董漢松[22]的方法（略有改動）。以不加酶液為空白對照，將檢測液3.1 mL（即2 mL pH 7.8 PBS沖液+1 mL 0.02 mol/L L苯丙氨酸+100 μL酶液）放于水浴鍋內，30℃下反應30 min，在290 nm 處測OD值，計算PAL酶活性，以1 min內OD變化0.01為1個酶活性單位。

1.2.2.3 CAT活性測定

采用紫外光吸收法[23]。取0.05 mol/L PBS （pH 7.0）緩沖液100 mL，加入30%過氧化氫160 μL，搖勻，避光4℃保存。取2.9 mL CAT反應液，在30℃水浴鍋中預熱15 min，加入100 μL酶液，搖勻，快速盛入比色皿，在波長 240 nm下測OD初始值及3 min時的OD值，計算CAT酶活性，以1 min內OD變化0.1為1個酶活性單位。

1.2.2.4 POD活性測定

采用愈創木酚法[24]。量取0.05 mol/L PBS （pH 6.0）緩沖液50 mL，加入0.05 mmol/L愈創木酚28 μL，磁力攪拌器上（30℃）攪動，溶解，冷卻后，加入30% H2O219 μL，搖勻，低溫保存以備用。取3 mL POD反應液，加入30 μL酶液混勻，以加30 μL PBS緩沖液（pH 7.8） 為對照，在470 nm處測0、2 min的OD值，計算其POD酶活性，以1 min內OD變化0.01為1個酶活性單位。

1.3 數據處理

試驗數據采用Excel和SPSS軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 供試材料離體葉片、枝條接種潰瘍病病菌后發病情況比較

從表1、圖1可以看出，供試材料的離體葉片、枝條接種M228后開始發病的時間、發病率明顯不同。其中，毛花獼猴桃‘M9808的離體葉片接種M228后10 d出現病狀，發病率4.4%，病情指數為2.2，高抗，離體枝條接種M228后20 d出現病癥，出現時間最晚，接種后25 d發病率僅為8.6%;對萼獼猴桃‘S9801、美味獼猴桃‘M06、‘米良1號離體葉片接種M228后6 d開始發病，10 d后的發病率分別為25.8%、30.0%、32.6%，病情指數分別為28.0、30.4、34.8，均為耐病，離體枝條接種M228后15 d出現病癥，接種后25 d的發病率分別為29.2%、34.8%、38.7%;中華獼猴桃‘Z12離體葉片接種M228后4 d開始發病，接種后10 d的發病率為52.2%，病情指數為50.7，感病，離體枝條接種后10 d出現病癥，接種后25 d發病率僅為59.8%;‘東紅、‘紅陽離體葉片接種M228后2 d開始發病，接種后10 d的發病率分別為57.1%、84.8%，病情指數分別為53.3、78.7，分別為感病、高感，離體枝條，接種M228后10 d出現病癥，接種后25 d的發病率分別為67.2%、81.4%。

2.2 供試材料離體葉片、枝條接種潰瘍病病菌后病斑大小比較

從圖2～圖5可知，供試材料離體葉片、枝條室內接種M228后，各材料的病斑大小差異顯著（經Duncans方差分析，P<0.05）。其中，離體葉片接種后10 d，毛花獼猴桃‘M9808發病最輕，其病斑面積/葉盤面積（F）最低，僅為2.8%，，約為對照的1/25;對萼獼猴桃‘S9801次之，F為27.8%，約為對照‘紅陽的2/5;‘紅陽感病最重，F為71.4%。離體枝條接種Psa后25 d，毛花獼猴桃‘M9808的病斑最短，為3.4 mm，約為對照的1/11;對萼獼猴桃‘S9801次之，為11.3 mm，約為對照的1/4;對照病斑最長，為44.3 mm。各材料以病斑大小排序，抗性大小依次為：毛花獼猴桃‘M9808>對萼獼猴桃‘S9801>美味獼猴桃‘M06>美味獼猴桃‘米良1號>中華獼猴桃‘Z12>中華獼猴桃‘東紅>中華獼猴桃‘紅陽（CK）。

2.3 供試材料離體枝條接種Psa后相關酶活性比較

從圖6～圖8可看出，供試材料離體枝條接種M228后，各材料的PAL、CAT、POD酶活性差異較大，抗病品種的相關酶活性均比感病品種高，且酶活性峰值出現時間也較早。其中，毛花獼猴桃‘M9808的PAL峰值最高，接種后5 d出現，出現時間最早，比對萼獼猴桃‘S9801、美味獼猴桃‘M06、‘米良1號提早5 d出現，比中華獼猴桃‘Z12、‘東紅、‘紅陽提早10 d出現;其CAT、POD活性峰值也最高，接種后10 d出現，與對萼獼猴桃‘S9801、美味獼猴桃‘M06、‘米良1號峰值出現時間相同，但比中華獼猴桃‘Z12、‘東紅、‘紅陽提早5 d出現。

3 討論

獼猴桃潰瘍病致病性強、根除難、范圍廣、危害大。目前，對此病的防治主要采用化學藥劑與栽培措施相結合的方式。如Serizawa等[25]、陽廷密等[26]、秦虎強等[27]的田間試驗結果表明，200 μg/mL鏈·土霉素1 g/L、80%乙蒜素EC 10倍液、72%農用硫酸鏈霉素SPX 2.0 mg/mL等藥劑預防效果較好。30余年來，國內外學者在栽培上對獼猴桃潰瘍病防治取得了一定成果，但防治效果均具有一定的局限性，生產中易受當年氣候、地理位置、果園土質及果農管理水平的影響。近年來，由于長期頻繁過量使用化學藥劑，已引起病菌抗藥性增強、農藥殘留物增多、果實品質下降等一系列問題。因此，栽培抗病品種是防治Psa最經濟、有效、實用的方法，選育抗病品種、利用抗性資源作為砧木防治Psa，是今后研究工作的重點。

前人研究表明，獼猴桃體內相關酶活性與植株對Psa的抗性密切相關。李庚飛[13]、李淼[14]、石志軍等[15]通過測定獼猴桃枝條感病前后相關酶的活性，發現枝條感病后抗病品種的相關酶活性均高于感病品種，與本試驗的結果一致。易盼盼[16]通過測定5個品種盆栽苗接種Psa后的相關酶活性，發現各品種酶活性均顯著增加，其中，抗病材料毛花獼猴桃‘M9808接種Psa后10 d其POD、PAL、CAT達到峰值，而中華獼猴桃‘紅陽接種Psa后15 d其POD、PAL達到峰值，但CAT活性變化不大，這與本試驗結果不同，這可能與供試材料枝干部位、粗度及酶液提取過程中的處理方法有關，具體原因有待進一步分析。

抗病資源是選育獼猴桃抗病品種的物質基礎，獼猴桃種間對Psa敏感程度不同。石志軍等[15]通過室內離體接種評價了3個獼猴桃種的24個不同品種及資源，發現3個毛花獼猴桃材料對Psa抗性強，而多數中華獼猴桃材料抗性較差;張慧琴等[28]通過室內離體接種評價了3個種的18個不同品種及資源，發現中華獼猴桃抗性最差，而美味獼猴桃的供試材料抗性差異較大;劉娟[29]通過室內離體接種，發現8個種25個雌性16個雄性獼猴桃資源及品種中，軟棗獼猴桃‘魁綠（雄）高抗，毛花獼猴桃‘毛花（雄）中感，中華獼猴桃‘紅陽（雌）中感，‘紅陽（雄）感病，這與石志軍等[15]的研究結論不一致，也與本試驗的結果不同，這可能與接種菌株、接種方法和供試材料的枝干情況有關。幾十年來，國內外關于獼猴桃品種對Psa的抗性研究較多，但多屬中華獼猴桃、美味獼猴桃或毛花獼猴桃的品種或資源，其他獼猴桃種較少。湘西地區獼猴桃種植歷史悠久，有美味、紫果、對萼、京梨等17個獼猴桃種[30]的野生資源，為獼猴桃抗性資源篩選和抗病育種工作的開展提供了豐富的材料來源。本試驗選擇了4個種7個獼猴桃材料，從種來看，毛花獼猴桃對Psa抗性最強，對萼獼猴桃次之，中華獼猴桃抗性最差;從資源及品種看，毛花獼猴桃‘M9808對Psa的抗性最強，對萼獼猴桃‘S9801次之，中華獼猴桃‘紅陽最差。說明毛花獼猴桃‘M9808可作為今后抗病育種或抗性砧木的理想材料。但本試驗選用的材料有限，下一步需擴大獼猴桃鑒定范圍，進一步篩選高抗獼猴桃Psa的種質資源。

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（責任編輯：楊明麗）