崗梅枝枯病病原鑒定

傅昱 李燕霞 劉婉蓉

摘要 為明確引起崗梅Ilex asprella枝枯病的病原，對從廣東梅州采集的崗梅枝枯病病部分離的致病菌株Gangmei 2進行了形態學觀察，并運用MEGAX構建了病原菌株rDNA內轉錄間隔區（internal transcribed spacer， ITS）的系統發育樹。結果顯示：病原菌的形態學特征與擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis真菌相似，在系統發育樹中該菌株與小孢擬盤多毛孢菌Pestalotiopsis microspora在同一分支上。因此，初步將崗梅枝枯病病原菌鑒定為小孢擬盤多毛孢菌P.microspora。

關鍵詞 崗梅; 枝枯病; 病原鑒定; 小孢擬盤多毛孢菌

中圖分類號： S 432.1

文獻標識碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018268

Abstract The pathogen causing branch blight of Ilex asprella was identified by Kochs postulates， morphological characteristics and phylogeny analysis of rDNA internal transcribed spacer （ITS）. The results showed that the pathogenic isolate Gangmei 2 from diseased I.asprella samples from Meizhou， Guangdong province was similar to Pestalotiopsis fungus in morphological characteristics. The isolate Gangmei 2 was in the same clade with Pestalotiopsis microspora by construction of phylogenetic tree between the isolate and the related isolates from GenBank.Therefore， the pathogen that causing branch blight of I.asprella was preliminarily identified as P.microspora.

Key words Ilex asprella; branch blight; identification of the pathogen; Pestalotiopsis microspora

崗梅Ilex asprella （Hook. et Arn.） Champ. ex Benth.屬冬青科冬青屬Ilex L.，分布于廣東、廣西等地[1]，是我國南方民用中藥，具有清熱解毒、生津止渴、利咽消腫、散瘀止痛之功效，臨床用于治療感冒發熱、肺熱咳嗽、熱病津傷口渴、咽喉腫痛、跌打瘀痛等病癥[2]。

崗梅的藥用價值之廣使其市場需求量越來越大，崗梅的栽培面積也隨之擴大。枝枯病是崗梅大面積種植過程中的一種主要病害，株發病率為10%以上。崗梅枝枯病主要危害崗梅的主干、側枝和嫩梢，引起發病枝條萎蔫、干枯，樹勢衰弱，生長速度緩慢，崗梅的產量和品質下降。關于崗梅枝枯病病原的報道，袁勤峰等[3]認為引起廣東崗梅枝枯病的病原菌是膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides complex，何凌冰等[4]則認為該病由葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea引起，但是否存在其他病原菌引起廣東省梅州市平遠縣崗梅生產基地上的崗梅枝枯病，并不清楚。因此，本研究對崗梅枝枯病病原菌進行鑒定，旨在對該病害的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：供試健康崗梅植株株高約40 cm，由華潤三九醫藥股份有限公司提供;罹病崗梅樣本于2016年10月采自廣東省梅州市平遠縣的華潤三九醫藥股份有限公司中藥材種植基地。

培養基：PDA，參照《植病研究方法》[5]配方配制。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化與致病性測定

采用常規組織分離法對田間采回的罹病崗梅樣本進行分離，將獲得的培養物在顯微鏡下用無菌接種針挑取單菌絲片段進行兩次菌株純化，獲得純培養分離物。致病性測定采用針刺法在無病健康且長勢相近的崗梅幼苗莖部進行。將純化后的菌株在PDA平板上28℃培養3～4 d后取直徑1 cm的菌絲塊貼住針刺部位，并用濕潤的棉花覆蓋固定，對照組接種直徑1 cm的無菌PDA培養基，每個處理設置5個重復。于28℃光照條件下保濕培養5～10 d后，觀察分離物的致病情況。對接種后發病的組織再次進行病原菌分離純化，比較該分離物與接種病原菌的形態異同。

1.2.2 病原菌的形態觀察

將4℃斜面保存的菌株轉至PDA平板上，于28℃培養箱中培養3～7 d，觀察并記錄菌落特征，每日測定菌落大小。待菌落產孢后利用鏡臺及目鏡測微尺測定分生孢子的大小，記錄并統計。

1.2.3 病原菌的分子鑒定

采用Chi等[6]的方法提取病原真菌總基因組DNA，對rDNA內轉錄間隔區（ITS）進行擴增。擴增所用的引物為ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）[7]。PCR反應體系（25 μL）：2×Taq PCR Green Mix 12.5 μL、DNA模板5 μL、5 μmol/L ITS1和ITS4各1 μL、Nucleasefree Water 5.5 μL;PCR擴增反應程序：94℃預熱3 min;94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環;72℃再延伸7 min;4℃保存。

擴增結束后取5 μL PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，最后將目標片段送往華大基因科技股份有限公司進行測序。測序結果與GenBank中的數據進行BLAST同源性比對，并運用MEGA 7.0進行系統發育分析。

2 結果與分析

2.1 崗梅枝枯病的癥狀特點及病原菌致病性測定

崗梅枝枯病主要危害崗梅的主干、側枝和嫩梢，引起發病枝條萎蔫、干枯，樹勢衰弱，生長緩慢。嫩梢發病時枝條由綠色變為深褐色，嫩葉和幼莖失水，干枯（圖1a～b）。主干和側枝初侵染時，病斑處失綠變褐，呈條狀，病斑中心呈現出黑褐色的斑塊，病斑周圍淺褐色，病斑逐漸擴散侵染，后整個病斑成為黑褐色，嚴重時病斑環繞大部分主莖，導致病斑以上部位因養分輸送受阻而失水失綠干枯。

從病組織上獲得3個分離物：Gangmei 1、Gangmei 2和Gangmei 3。利用針刺法對其進行致病性測定，結果顯示，只有分離物Gangmei 2在接種9 d后，崗梅枝干部出現深褐色病變，病變部位中間有白色羽狀物（圖1c），與原采回的標本崗梅枝枯病在田間自然病害特征一樣，病斑有逐漸擴大的趨勢，分離物Gangmei 1、Gangmei 3未引起崗梅產生病變。從接種后崗梅發病莖部的病健交界處組織上（圖1c）再次進行病原菌的分離純化，此次分離的菌物在PDA平板上的菌落形態（圖2a～b）和分子特征（ITS）與原接種體一致。

2.2 崗梅枝枯病病原菌的形態學特征

Gangmei 2在PDA培養基上于28℃培養箱中培養5 d后的菌落近圓形，邊緣規則，正面為白色絲絨狀，反面淡黃色，有輪紋，菌體由內而外呈波浪形擴張，整體蓬松，10 d后產孢（圖2a～b）;對病部進行切片觀察到分生孢子盤埋生于寄主表皮下，黑色，單腔，分生孢子整齊地排列在分生孢子盤內（圖2c）;光學顯微鏡下觀察到分生孢子大小為（19.8～29.5）μm×（52～9.9）μm（圖2d），呈紡錘形或長梭形，直或微彎，具4個隔膜，5個細胞，分隔處稍有縊縮，基部和頂部細胞無色，中間3個細胞均為淡橄欖色，其中上部兩個細胞顏色較下部細胞顏色深;成熟孢子頂端有2～4根無色透明附屬絲，分支或不分支，長為24.5～36 μm，基部細胞平截，具一內生附屬絲，長為9.05～12.96 μm，不分支。根據病原菌的形態特征，此病原菌屬于擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis真菌。

2.3 崗梅枝枯病病原菌的分子鑒定

利用真菌ITS通用引物ITS1和ITS4對病原菌Gangmei 2的rDNA內轉錄間隔區（ITS）進行擴增，獲得片段大小約為524 bp的產物。將擴增產物序列（MG820124）在GenBank中進行BLAST比對，用MEGA 7.0按照NJ（neighborjoining）法構建Gangmei 2及相關真菌的系統發育樹（圖3），結果表明，病原菌株Gangmei 2與Pestalotiopsis microspora strain CGJ4（KT459350.1）、P.microspora strain Pm1（MH094237.1）、P.microspora strain DPX32（KY849799.1）和P.microspora strain LK11（DQ001009.1）在同一分支上。

3 討論

本研究對采自廣東省梅州市平遠縣的崗梅枝枯病樣品進行組織分離純化，經柯赫氏法則驗證獲得崗梅枝枯病病原菌株，觀察病原菌株形態學特征并對病原菌株的ITS序列進行分析后，初步將崗梅枝枯病的病原菌鑒定為小孢擬盤多毛孢P.microspora。

本研究結果與袁勤峰等[3]報道的崗梅枝枯病病原為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides complex，何凌冰等[4]報道的崗梅枝枯病病原為葡萄座腔菌B.dothidea不同，其原因可能是采樣的地點、季節、崗梅植株的生長環境不同，也可能是崗梅枝枯病可由多種病原菌引起或存在多種病原菌復合侵染的情況。

韋繼光[8]的研究表明，擬盤多毛孢屬分類的首要特征是分生孢子有色胞的顏色類型，其次是頂端附屬絲（頂端附屬絲末端是否膨大、是否呈單根后分支、附屬絲著生位置以及根數）及基部附屬絲的有無、是否分叉。宋利沙[9]的研究表明，基部附屬絲的有無及是否分叉與頂端附屬絲是否呈單根后分支以及著生的位置，不是很重要的分類特征。

本研究使用了ITS序列對崗梅枝枯病病原菌進行分子鑒定。宋利沙[9]的研究表明，該序列能區分擬盤多毛孢屬中包括P.microspora在內的6個物種，建議把ITS作為擬盤多毛孢屬的主要條形碼，βtub作為擬盤多毛孢屬的輔助條形碼，對于個別比較難以鑒別的種類，可采取ITS+βtub+EF1α序列組合建立分子系統發育樹對擬盤多毛孢屬物種進行識別。本研究利用ITS序列構建病原菌株及相關真菌的系統發育樹能很好地將P.microspora與其他菌株區分開。

傳統的擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis分類多數以Guba[10]的檢索表為依據，但該檢索表存在形態特征重疊嚴重，種間區別不夠明確等不足之處[11]。擬盤多毛孢屬真菌在培養時也會出現同種菌株在不同培養基上的分生孢子長度、頂端附屬絲長度、基部附屬絲長度等形態指標有明顯差別的現象[12]，不同的研究者對同一個種的描述也有差別。在擬盤多毛孢屬真菌的分類和鑒定中，應統一培養基和培養條件從而對擬盤多毛孢屬真菌進行形態特征的比較并結合形態特征和分子特征進行正確鑒定。迄今為止，國內外未見有小孢擬盤多毛孢P.microspora引起崗梅枝枯病的報道，該發現為崗梅枝枯病的防治提供了一定的理論依據。

參考文獻

[1] 曾坤，陳良華，丘琴，等.崗梅根的研究進展[J].中國民族民間醫藥，2012，21（18）：2829.

[2] 黃錦茶，陳豐連，陳海明，等.崗梅根的化學成分研究[J].中草藥，2012，43（8）：14751478.

[3] 袁勤峰，鄭露，劉浩，等.廣東崗梅枝枯病病原鑒定及生物學特性研究[C]∥中國植物病理學會2015年學術年會論文集.北京：中國農業出版社，2015：188.

[4] 何凌冰，吳惠萍，游春平，等.崗梅枝枯病病原鑒定[J].廣東農業科學，2017，44（1）：111114.

[5] 方中達.植病研究方法[M].第3版.北京：中國農業出版社，1998：46.

[6] CHI M H， PARK S Y， KIM S， et al. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host [J/OL]. PLoS Pathogens， 2009， 5（4）： e1000401.

[7] WHITE T J， BRUNS T， LEE S B. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics [M]∥INNIS M A， GELFAND D H， SNINSKY J J， et al. PCR protocols： A guide to methods and application. San Diego， California， New York： Academic Press Co， 1990： 315322.

[8] 韋繼光.羅漢松科、山茶科和紅豆杉科植物內生擬盤多毛孢的多樣性及擬盤多毛孢屬分子系統學研究[D].杭州：浙江大學，2004.

[9] 宋利沙.擬盤多毛孢屬的分類及分子系統學和分子條形碼研究[D].南寧：廣西大學，2016.

[10]GUBA E F. Monograph of Monochaetia and Pestalotia[M]. U.S.A.： Harvard University Press， 1961： 54250.

[11]韋繼光，徐同，潘秀湖，等.擬盤多毛孢屬的分類學研究進展[J].廣西農業生物科學，2006，25（1）：7885.

[12]韋繼光，徐同，郭良棟.擬盤多毛孢屬形態穩定性及分類學意義[J].萊陽農學院學報（自然科學版），2006，23（4）：280284.

（責任編輯：楊明麗）