豁痰解毒通絡飲干預IRE1α/XBP1信號通路參與球囊損傷后兔頸動脈再狹窄的機制研究

單斯嘉，鄧 悅，于克英，孫哲宇，石 銳

針對治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病所推出的經皮冠狀動脈腔內成形術(PTCA)具有劃時代的意義，而支架內再狹窄(in-stent restenosis， ISR)問題也是近年來的研究熱點。炎癥反應最終造成了內皮細胞損傷，進而引起動脈粥樣硬化斑塊(atherosclerosis， AS)。相關文獻已經證明，內質網應激(endoplasmicreticulum stress， ERS)有可能通過其偶聯的炎癥反應和細胞凋亡的作用參與新生內膜形成，在ISR的病理過程中起著重要的作用，并貫穿AS發展的整個過程[1]。內質網位于各種真核細胞中(除哺乳動物的成熟紅細胞)，其功能是蛋白質的合成、加工、轉運、調節細胞內鈣離子濃度等，當內質網穩態遭到破壞后，會產生ERS。ERS是細胞在感受到自身調節機制失衡時的一種自我保護，ERS短時間可以增加細胞抵抗應激的功能，可以維持內質網的穩態平衡，然而長時間的劇烈ERS可破壞細胞功能，導致細胞無法調節其自身機制并最終導致細胞凋亡。根據研究發現，通過控制ERS 也許是打開治療AS的一個新的思路[2]。內質網將會通過3種信號通路引起ERS：未折疊蛋白反應(unfolded protein response， UPR)，內質網超負荷反應(endoplasmicreticulum-overloaded response，EOR)和固醇調節級聯反應(sterol regulatory element binding protein，SREBP)。其中UPR通路是最保守最為清楚的通路。UPR激活蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)、肌醇需求酶1( inosito-l requring enzyme1， IRE-1)和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)3條信號通路。這三者都是內質網跨膜蛋白。IRE-1被激活后具有核糖核酸內切酶活性， 在胞漿中剪切的X盒結合蛋白1(X-box-binding protein-1，XBP1)mRNA， 編碼具有轉錄活化域的蛋白， 誘導大量ERS反應的基因表達， 幫助細胞解除ERS[3]。中醫學認為AS病機為本虛標實，痰濁、瘀血及外邪是AS的關鍵病理因素，國醫大師任繼學教授提出“伏邪即隱藏于人體之虛處”，提出以“伏邪內藏，毒損脈絡”為中心的學說，而痰瘀伏絡、日久不愈、蘊結成毒是ISR的關鍵病機[4]。根據此病機創立的以“益氣化瘀，豁痰通絡”為治則的豁痰解毒通絡飲在臨床上收到了很好的療效，但具體作用機制尚未完全明確。本研究旨在通過建立球囊損傷后兔頸動脈再狹窄模型，探討豁痰解毒通絡方是否與干預IRE1α/XBP1通路相關。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 日本雄性大耳白兔共24只，3～4月齡，體重1.8～2.2 kg，分籠飼養于中國中醫科學院基礎理論研究所清潔級動物房。大耳白兔由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號為SCXK(京)2015-0001。兔飼料由科奧協力有限公司提供，許可證號為SCXK(京)2014-0010，生產批號：GDAF161217。每只實驗兔每天給予120 g飼料1次。

1.1.2 藥品 豁痰解毒通絡飲，由金銀花、水蛭、甘松、當歸等藥物組成。生藥由長春中醫藥大學附屬醫院藥劑科供給，生藥濃度為2.3 g/mL。阿托伐他汀每片20 mg，由輝瑞制藥有限公司生產，生產批號：S90893，批準文號：國藥準字：H20051408。

1.1.3 主要儀器和試劑 PTCA球囊導管(2.5 mm×20 mm，美國Medtronic公司)；戊巴比妥鈉由北京化學試劑公司進口分裝；青霉素鈉：華北制藥股份有限公司，8×105U/瓶；低分子肝素鈉(吉派林)：杭州九源基因工程有限公司；耗材：血清管，枸櫞酸鈉抗凝管，1.5 mL EP管，一次性采血針頭，槍頭，2#縫合線，2 mL無菌注射器， 5 mL無菌注射器。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備 將實驗兔24只分為4組：假手術組、模型組、中藥組(豁痰解毒通絡組)、西藥組(阿托伐他汀組)，每組6只。4組兔適應性喂養7 d。頸動脈球囊損傷方法：手術前1 h皮下注射低分子肝素0.1 mL/kg可預防急性血栓形成。麻醉，3%戊巴比妥鈉1 mL/kg，耳緣靜脈給藥。頸部備皮、消毒，從氣管正中線切開皮膚，并將頸總動脈直接向遠心端鈍性分離，在頸外動脈0.8～1.2 cm處結扎一條線，分離頸內動脈，在距離分叉處約3 mm結扎一活結。在頸總動脈纏雙繞線，準備解繞后用動脈夾夾閉頸總動脈，使用虹膜剪，在頸外動脈剪一小口，插入球囊導管，長度8 cm，球囊加壓至7個大氣壓，原位擴張3次，撤出球囊，結扎頸外動脈近心端。將傷口縫合并消毒，術后連續3 d肌內注射青霉素8×105U及皮下注射吉派林0.1 mL/kg。

1.2.2 給藥 術后第2天連續灌胃28 d。假手術組、模型組灌胃等量蒸餾水，中藥組用量為6.67 g/kg，西藥組為1.42 mg/kg。每日1次，28 d后取材。

1.3 HE染色 用鹽水清洗頸總動脈組織，將其固定在4%多聚甲醛中，固定在包埋盒中，并在流水中漂洗30 min。將其在乙醇中脫水，再置于二甲苯中透明，浸蠟包埋。切片后烘干。用二甲苯脫蠟后，乙醇水化，用蘇木素及伊紅染色，用75%乙醇脫水，透明，用中性樹膠封片，完成染色。

1.4 Westernblot法檢測兔頸動脈IRE1α、XBP1蛋白含量 通過加入液氮研磨組織后，用裂解緩沖液提取蛋白質以測定純度和濃度，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，轉膜為45 m，封閉用3%脫脂奶粉，TBST洗4次，敷一抗過夜后回收一抗，然后TBST洗4次，敷二抗1 h，TBST洗3次后加顯色劑至顯色。用Image J檢測灰度值。SPSS 19.0統計數據。

1.5 qPCR測定IRE1α/XBP1的mRNA的表達 用Trizol試劑盒說明，按步驟提取組織中的RNA，Bio-spec測定濃度和純度。重復3次，樣品濃度在1.8～2.0。IRE1α引物(5′-cca gca cca gca gtt cca gaa g-3′；5′-tgc agg cat cca gga ggt cag-3′)。XBP1引物(5′-tgg tta ctg agg cag agg-3′；5′-gaa gag tca gtg ccg tca gaa tcc-3′)。β-actin引物(5′-ggc atg gag tcg tgt ggc atc-3′； 5′-cgt gtt ggc gta cag gtc ctt g-3′)。按照Takara逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒進行逆轉錄和qPCR反應。反應結束后通過確認qPCR的擴增曲線和溶解曲線，記錄各指標Cq值，SPSS 19.0統計各組數據。

2 結 果

2.1 HE染色結果 假手術組內膜連續、完整，無增生，無狹窄。模型組較假手術組血管內皮下新生內膜明顯增厚，管腔狹窄，外膜增生伴炎細胞浸潤。中藥組和西藥組與模型組相比內膜增生相對減少，管腔狹窄程度減低。詳見圖1。

圖1 HE染色檢測兔頸動脈病理改變(40×)

2.2 豁痰解毒通絡飲對IRE1α/XBP1的蛋白表達影響 結果顯示，與假手術組相比，模型組IRE1α，XBP1的mRNA含量顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，中藥組及西藥組干預后，其mRNA含量顯著降低(P<0.05)。詳見圖2、表1。

A為假手術組；B為模型組；C為中藥組；D為西藥組圖2 兔頸動脈中IRE1α、XBP1的蛋白表達電泳圖

表1 兔頸動脈中IRE1α、XBP1的蛋白表達比較(±s)

與假手術組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

2.3 豁痰解毒通絡飲對IRE1α、XBP1的mRNA表達影響 qPCR結果顯示，與假手術組相比，模型組IRE1α的mRNA含量顯著增加(P<0.05)，與模型組相比，中藥組及西藥組干預后，其mRNA含量顯著降低(P<0.05)，但中藥組與西藥組相比差異無統計學意義(P>0.05)。XBP1趨勢與IRE1α相同，模型組與假手術組相比，mRNA含量顯著增加，兩組間差異有統計學意義(P<0.05)，而中藥組與西藥組均較模型組顯著降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 兔頸動脈中IRE1α、XBP1的mRNA表達情況(±s)

與假手術組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

3 討 論

冠心病介入術推出后大大降低了冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的死亡率，但PTCA術后ISR的發生率為30%～50%[5]，再狹窄的發生原因有許多，如炎癥反應、內皮細胞功能受損、腎素-血管緊張素系統過度激活、多因子作用都有可能是導致ISR發生[6]。在再狹窄的過程中，ERS起到了重要的作用。ERS初始時，首先啟動的是UPR途徑，UPR共有3種通路介導：ATF6、PERK、IRE1。其中IRE1α是內質網的一種固有蛋白，它同時具有蛋白激酶和核糖核酸內切酶活性。IRE1α通過其核酸內切酶活性產生含有b-ZIP結構域有活性的轉錄因子XBP1，激活IRE1-XBP1信號通路，IRE1-XBP1是UPR通路中最保守的通路，在ERS應激中發揮著非常重要的作用。而XBP1作為IRE1α的間接產物，是一種重要的反式作用因子，可調控大量的基因表達，從而緩解ERS應激，維持內質網穩態。有眾多研究表明XBP1在AS發生過程中起著重要的作用[7]。

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病屬于中醫學“胸痹”“心痛”的范疇，治療時不僅要針對胸痹之脈絡瘀阻，也要著眼于整體。中醫學認為，導致ISR的關鍵在于虛、瘀和熱毒。虛即正氣虧虛，PTCA術后再狹窄的病機是本虛標實，本虛以氣虛為主，標實以痰濁，瘀血為主。在治療的早期階段，應該活血化瘀、清熱解毒，并在后期進行辨證分型、補正養陰[8]。同時，血瘀也是該病的重要原因。血瘀的成因可以是寒凝、氣滯、陽虛、氣陰兩虛或者痰瘀互結。大量研究表明，PTCA還會在冠狀動脈狹窄期間損害血管內膜，導致血液瘀滯[9]。因此，介入后有必要加強活血化瘀、祛痰通絡、降脂和抗血小板藥物的治療。導致ISR的另一個重要發病機制是痰阻心脈，痰瘀既是血瘀證的病理產物又是其病因?；钛龅闹畏ㄊ侵委煿谛牟〉囊话阋幝?，但治療期間也必須考慮痰濕的因素，在活血化瘀的基礎上需要兼顧祛痰濁、利水濕，才能夠取得更好的療效[10]。鄧悅教授根據多年的臨床經驗，認為此病病位在絡脈，為本虛標實之證。同時強調伏邪理論在心病治療中的重要價值。心系疾病早在出現癥狀前就以伏邪的形式存在[11]，并以痰瘀伏絡、蘊結成毒為病機關鍵。鄧悅教授在此基礎上提出了“PTCA 術后再狹窄與痰瘀伏絡-內癰相關”“豁痰解毒通絡方藥為其主要干預途徑”的科學研究假說。現代藥理學研究發現，豁痰解毒通絡飲中的主要藥物中，金銀花有解熱抗炎，抗菌抗病毒的功效；瓜蔞可增加冠狀動脈血流量，保護缺血心肌，促進微循環，增加缺氧耐受性、抗凝血和降低血清膽固醇，抗菌等多種活性；水蛭具有抗凝血、抗血栓、抗炎、抗纖維化的作用[12-15]。

本研究觀察豁痰解毒通絡飲對PTCA術后兔頸動脈內膜再狹窄的影響，結果發現，豁痰解毒通絡飲可顯著降低頸動脈內皮增生面積，改善血管炎癥反應，緩解頸動脈內膜狹窄，且效果優于西藥組。同時可下調IRE1α、XBP1的蛋白以及mRNA的表達。說明豁痰解毒通絡飲有可能通過IRE1α-XBP1通路抑制動脈內膜的增生。這為中藥治療PTCA后ISR的臨床應用提供了理論依據，為探討中藥復方干預ISR的作用機制奠定了理論基礎。