珠子參總皂苷對心肌缺血再灌注大鼠血清MCP-1、MIF和TNF-α的影響

張 磊，許 強，李盈盈，劉宏軍

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是指心肌缺血一定時間后，再次恢復心肌血供反而會加重心肌損傷。急性心肌梗死病人在接受最佳的再灌注治療后，仍有10%～30%會發生MIRI，MIRI被認為是導致心肌梗死后心力衰竭、死亡的主要原因[1]，因此，如何防治MIRI顯得尤為重要。有研究表明，炎癥因子水平的高低與缺血后心臟功能損害程度和心肌細胞凋亡數量直接相關，提示炎癥反應在MIRI中起著重要作用[2-3]。單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)是一種趨化因子，在心肌MIRI時表達增加，可引發一系列炎癥反應，并與巨噬細胞移動抑制因子(MIF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等共同參與炎癥的發生發展，在MIRI中發揮著重要作用[4]。在關于如何減輕MIRI程度的研究中，采用中藥有效成分提取物或中藥復方進行預處理，顯示出一定的優勢[3]。珠子參是五加科人參屬植物珠子參的干燥根狀莖，具有補肺養陰、祛瘀止痛、止血之功，珠子參總皂苷是其主要活血成分之一[5]。有研究表明，珠子參總皂苷對心腦血管疾病有著廣泛的藥理作用[5]。本研究旨在探討珠子參總皂苷對大鼠MIRI保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠40只，體質量252～306 g，由三峽大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(鄂)2011-0012]。參照國家實驗動物飼養和使用指南，室溫(22±2)℃，濕度(60±5)%，12 h明暗循環，自由飲食和飲水。

1.2 藥物與試劑 珠子參總皂苷，由三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室提供，純度為96.5%；MCP-1(南京建成科技有限公司)；MIF(南京建成科技有限公司)；大鼠TNF-α(南京建成科技有限公司)；20%氨基甲酸乙酯溶液(湖北信康醫藥化工有限公司)。

1.3 主要儀器 電子天平(上海天平儀器廠)；LDZ5-2 型自動平衡離心機(北京醫用離心機廠)； ALC-V8 型動物呼吸機(上海奧爾特生物科技有限公司)；16導生理信號采集分析系統(美國 Biopac 公司)。

1.4 分組與給藥 采用隨機數字表法將大鼠分為5組：假手術組、模型組和珠子參總皂苷低劑量組(50 mg/kg)、中劑量組(100 mg/kg)、高劑量組(200 mg/kg)。珠子參總皂苷組灌胃給予相應的藥物，灌胃體積為20 mL/kg，每天給藥1次，連續給藥1周，假手術組和模型組給予同體積的生理鹽水。

1.5 模型建立 大鼠MIRI模型的制備參考文獻[6]，具體如下：術前禁食12 h，末次給藥30 min后，采用20%氨基甲酸乙酯溶液(1.5 g/kg)行腹腔麻醉后，將大鼠仰臥固定于手術臺上。經口腔行氣管插管，連接小動物呼吸機，呼吸頻率80次/min，潮氣量5～6 mL，呼吸比1∶2。針形電極插入四肢皮下，連接心電圖機，記錄Ⅱ導聯心電圖。在胸骨左側第4肋間，沿肋間隙方向剪開1 cm左右的切口，鈍性分離肌肉組織，用彎頭鉗打開胸腔，擠壓心臟，使其充分暴露。在左心耳和肺動脈圓錐間找到與左冠狀動脈伴行的冠狀靜脈，在左心耳下方2 mm處以6/0無損傷縫合針穿線，進針深度為1.0～1.5 mm，寬度為2～3 mm。結扎前，于冠狀靜脈處放置棉線，連同棉線(1.5～2.0 mm)一起結扎冠狀動脈前降支，造成心肌缺血。30 min后再次開胸，剪斷結扎線，使其再灌注120 min。假手術組只在相應部位穿線不結扎。模型復制成功的標準：結扎冠狀動脈后其遠端心肌顏色變灰白，Ⅱ導聯心電圖ST段明顯抬高，表示心肌缺血復制成功；剪斷結扎線后，心肌顏色由灰白逐漸恢復正常，抬高的ST段下降1/2以上為再灌注復制成功。

1.6 標本采集與監測 再灌注結束后，腹主動脈取血5 mL，靜置30 min后以3 000 r/min離心15 min，取血清，采用ELISA方法測定各組大鼠血清MCP-1、MIF和TNF-α。

2 結 果

2.1 大鼠在體MIRI模型評估 本研究共擬建立大鼠在體MIRI模型40只。在實際操作過程中，僅珠子參總皂苷中劑量組1只大鼠發生氣胸死亡，其余大鼠全部建模成功。

2.2 珠子參總皂苷對MIRI大鼠血清MCP-1、MIF和TNF-α的影響 與假手術組比較，模型組大鼠血清 MCP-1、MIF、TNF-α水平明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.01)； 與模型組比較，珠子參總皂苷高、中、低劑量組血清MCP-1、MIF、TNF-α水平均下降，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表 1。

表1 各組大鼠血清MCP-1、MIF、TNF-α水平比較(±s)

與假手術組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05

3 討 論

目前關于MIRI的機制研究有很多，炎癥反應被認為是MIRI的主要機制之一[7]。MIRI是一個復雜的病理生理過程，炎癥在其中扮演著重要角色。研究表明，炎癥細胞在再灌注早期即可侵入心肌組織，損傷心肌局部釋放大量的蛋白水解酶及促炎癥因子，進而誘導和加重心肌損傷[8-9]。

MCP-1是趨化因子家族成員之一，主要由內皮細胞、巨噬細胞、血管平滑肌細胞和單核細胞產生，能夠趨化、激活單核-巨噬細胞遷移并聚集在血管內膜下，最終能夠活化為巨噬細胞，吞噬類脂質，形成富含膽固醇酯的泡沫細胞，從而導致動脈粥樣硬化(AS)的發生[10]。MCP-1與冠心病關系密切，甚至可將其作為預測急性冠脈綜合征(ACS)的一個指標[11]。心肌缺血再灌注時，MCP-1表達增加，趨化和激活單核-巨噬細胞、T淋巴細胞和自然殺傷細胞等免疫細胞,引起一系列炎癥反應，從而加重心肌損傷[12]。CC類趨化因子受體2(CCR2)是MCP-1的特異性受體，可以介導單核細胞聚集并遷移浸潤到血管壁內，促進AS的形成。Hayasaki等[13]將小鼠CCR2基因敲除后，其缺血再灌注心肌炎性細胞浸潤顯著降低，心肌梗死面積縮小。MIF是一種新型炎癥因子，主要由單核細胞核內皮細胞分泌，具有多種獨特的性能和效能，可刺激巨噬細胞分泌基質金屬蛋白酶(MMPs)，在AS及不穩定斑塊的發展中發揮了重要作用。此外，MIF還可誘導MCP-1的表達并經由MCP-1的作用機制使巨噬細胞發生聚集，直接或間接地刺激巨噬細胞分泌一些細胞因子，產生炎癥放大效應[14]。TNF-α是體內重要的炎癥因子，由巨噬細胞產生，可通過自分泌方式作用于其他巨噬細胞，引起更多巨噬細胞的活化，從而放大炎癥反應。MCP-1、MIF與TNF-α相互之間的作用，構成一個復雜的炎癥反應系統，在啟動和促進心肌細胞的再灌注損傷過程中發揮了重要作用。

珠子參對改善缺血性損傷具有廣泛的藥理作用[5]。既往研究表明，珠子參總皂苷對心肌缺血性損傷具有較好的保護作用，其作用機制可能與抗氧化損傷有關[15]。通過本實驗發現，模型組大鼠血清MCP-1、MIF、TNF-α濃度顯著升高，珠子參總皂苷干預組大鼠血清 MCP-1、MIF與TNF-α的水平都明顯下降，提示珠子參總皂苷對MIRI大鼠心肌的保護作用機制可能與其抑制MCP-1、MIF和TNF-α的表達有關。