不同修飾磁納米顆粒提取DNA對HRM基因分型能力的影響探討

張 敏，張俊平，楊美娟，李凌霄，郜莉娜，沈明輝，尤崇革△

(1.蘭州大學第二醫院檢驗醫學中心，甘肅蘭州 730030；2.中國科學院蘭州化學物理研究所，甘肅蘭州 730030)

高分辨熔解曲線(HRM)作為一種新興的分子診斷技術，其不受突變位點和突變類型的限制，特異度和靈敏度高，操作簡便，目前已被廣泛地用于生物學及醫學各個領域研究[1-5]。由于HRM檢測的高靈敏性，其對核酸質量的要求也相對較高。磁固相萃取技術(MSPE)由于其快速、高效以及易于自動化的特點引起了越來越多的關注[6-10]。在MSPE中，避免了產生可能導致核酸降解的離心步驟，減少物理或化學因素對核酸的損害，同時，作為固相吸附劑的磁性顆粒(MNP)可以通過施加外部磁場而被很容易地除去[11-12]。為此，本研究制備并建立了3種基于磁珠的核酸提取方法，分別以3種突變位點及突變類型(rs12641369G>A、rs3114018C>A、rs2302515C>G)為例，探討其對PCR-HRM檢測的影響，并評價檢驗性能。

1 材料與方法

1.1標本來源 40例全血標本來自蘭州大學第二醫院體檢中心健康人群，平行采用天根公司的全血基因組DNA試劑盒、SiO2@Fe3O4、CTA@Fe3O4及Fe3O4提取300 μL全血。

1.2主要試劑與儀器 六水合氯化鐵(FeCl3·6H2O)、無水乙酸鈉(NaAc)、乙二醇、聚乙二醇10000、聚乙二醇6000和無水氯化鈉(天津大茂化學試劑廠)，正硅酸乙酯、殼聚糖(天津科密歐化學試劑公司)，緩沖液CL(北京天根公司)，洗脫液(日本富士公司)，Taq DNA 聚合酶和SYTO13染料(美國Life Technologies公司)，dNTP(美國Invitrogen公司)，Rotor-Gene Q PCR儀(德國QIAGEN公司)，Nano-drop 2000超微量分光光度計(美國Thermal Scientific公司)。

1.3方法

1.3.1磁珠制備 首先采用水熱法制備了羧基改性磁性Fe3O4納米粒子。FeCl3·6H2O(1.35 g)溶于乙二醇(40 mL)，借助于超聲波處理形成澄清溶液；再將NaAc(3.6 g)和聚乙二醇10000(1.0 g)加入到溶液中，劇烈攪拌混合物直至獲得均勻的深黃色溶液；將該溶液放入聚四氟乙烯高壓反應器中，在200 ℃條件下加熱48 h；產物用乙醇和水洗滌數次，并在60 ℃的氮氣條件下干燥10 h備用，最后得到Fe3O4磁性納米粒子。取250 mg Fe3O4顆粒加入30 mL乙醇超聲30 min；向燒杯中加入30 mL乙醇、60 mL乙醇胺及5.28 g超純水，并攪拌均勻；將上述液體與Fe3O4顆粒溶液混勻后放入三口燒瓶，邊攪拌邊滴加2 mL正硅酸乙酯(500 r/min)，再將轉速調至800 r/min，機械攪拌6 h，最后洗滌干燥，得到SiO2@Fe3O4。1 g Fe3O4顆粒加入一定量超純水超聲1 h，再加入100 mL 1%殼聚糖溶液(1%醋酸溶液稀釋)機械攪拌24 h，取150 mg上述顆粒加入4 mL 2.5%戊二醛溶液(0.2 mol/L磷酸鹽溶液配制)，200 r/min機械攪拌5 h，洗滌干燥得到CTA@ Fe3O4。

1.3.2核酸提取 柱提法核酸提取按照天根公司試劑說明書步驟進行。向300 μL EDTA-K2抗凝血液中加入300 μL無菌去離子水以破壞紅細胞膜，混合數次后，將混合液以12 000 r/min離心3 min，棄去上清液；在剩余的沉淀中加入緩沖液CL(300 μL)，混合數次；將混合物以12 000 r/min離心1 min，棄去上清液；制備150 mL蛋白酶K-緩沖液FG混合液(1∶100)并加入到沉淀中，倒轉幾次，直至沉淀物完全溶解；將離心管放入65 ℃金屬浴中溫浴10 min；向上述裂解液中加入300 μL結合溶液(20%PEG，4 mol/L氯化鈉，pH=2.0)，隨后加入40 ng SiO2@Fe3O4/CTA2@Fe3O4/Fe3O4；室溫下靜置10 min；在磁力分離架上分離結合物，棄去上清液。結合物用70%乙醇溶液洗滌2次并在室溫下干燥。加入50 μL洗脫液并在室溫下溫育10 min。最后磁分離，將洗脫液轉移至新管。

1.3.3DNA質量評價 DNA提取產物中取1 μL用超微量蛋白核酸檢測儀測定濃度、A260及A280，計算得率(濃度×洗脫液體積)和純度(A260/A280)。

1.3.4引物設計與合成 使用NCBI數據庫在線軟件Primer-BLAST設計引物，并使用在線工具UNAfold和uMelt進行引物驗證，引物由南京金思特(GenScript)科技有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 3個SNP位點的引物信息表

1.3.5PCR-HRM基因分型 反應體系10 μL，包括1 μL DNA 樣本，10×PCR Buffer 1 μL，0.08 μL Taq DNA 聚合酶(濃度5 U/μL)，10 mmol /L dNTP 0.2 μL，20 μmol/L引物各0.25 μL，10×SYTO 13染料0.5 μL，50 mmol/L的MgCl20.05 μL，最后加water-DEPC至10 μL。rs12641369和rs3114018反應條件為預變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 10 s，退火58 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 15 s，共15個循環；變性95 ℃ 10 s，退火56 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 15 s，共25個循環。rs2302515反應條件為預變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 15 s，共40個循環。隨后進行HRM分析，條件為95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，熔解曲線溫度區間為75～85 ℃，分辨率為每梯度0.2 ℃，通過熔解曲線峰型的改變進行基因分型。

1.3.6檢驗性能的評價 為評價靈敏度與特異度，特定義雜合和純合突變基因型為陽性，野生基因型為陰性。靈敏度為真陽性占真陽性與假陰性之和的百分比，特異度為真陰性占假陽性與真陰性之和的百分比。重復性采用批內10次重復評價，再現性采用批間重復10次。

2 結 果

2.1DNA提取質量比較 如表2所示，統計學分析顯示以離心柱法為對照，SiO2@ Fe3O4法得率與離心柱法相當，且差異無統計學意義(P>0.05)，CTA@Fe3O4法及Fe3O4法核酸提取得率均較離心柱法低，且差異有統計學意義(P<0.01)；5種方法提取核酸的純度(A260/A280≈1.80)之間差異無統計學意義(P>0.05)。PDA@Fe3O4法和SiO2@ Fe3O4法均具有良好的核酸提取質量。

注：從左到右依次為離心柱法、SiO2@Fe3O4、CTA@Fe3O4及Fe3O4的標準化熔解曲線圖(上)和求導熔解曲線圖(下)；最右側為rs12641369的測序驗證圖

圖15種核酸提取方法rs12641369的批量PCR-HRM熔解曲線圖

2.2靈敏度和特異度 在40例樣本中rs12641369、rs3114018和rs2302515有2例標本由于熔解峰飄移，不能直接基因分型，其余均可直接分型(如圖1～3)。這2例樣本后經與已知純合型樣本混熔和重新檢測后均能明確分型：所有樣本檢測結果與Sanger測序結果一致，4種核酸提取結合HRM方法在本次研究中靈敏度和特異度達到100%。

表2 4種核酸提取方法核酸質量的比較

注：-表示無數據

注：從左到右依次為離心柱法、SiO2@Fe3O4、CTA@Fe3O4及Fe3O4的標準化熔解曲線圖(上)和求導熔解曲線圖(下)；最右側為rs3114018的測序驗證圖

圖25種核酸提取方法rs3114018的批量PCR-HRM熔解曲線圖

注：從左到右依次為離心柱法、SiO2@Fe3O4、CTA@Fe3O4及Fe3O4的標準化熔解曲線圖(上)和求導熔解曲線圖(下)；最右側為rs2302515的測序驗證圖

圖35種核酸提取方法rs2302515的批量PCR-HRM熔解曲線圖

2.3重復性和再現性 在重復性實驗中，離心柱法、SiO2@Fe3O4法、CTA@Fe3O4法及Fe3O4法在rs12641369位點基因型GG對應熔解曲線的Tm的CV分別為0.6%、0.6%、0.8%和1.2%；t檢驗發現野生型和純合型Tm值差異均具有統計學意義(P<0.05)。在rs3114018位點基因型CC的TmCV分別為0.4%、0.8%、0.5%和1.3%；t檢驗發現野生型和純合型Tm值差異均具有統計學意義(P<0.05)；在rs2302515位點基因型CC的TmCV分別為0.7%、0.8%、0.5%和1.5%；t檢驗發現野生型和純合型Tm值差異均無統計學意義(P>0.05)。由于rs2302515C>G的純合型與野生型Tm值極為接近，本研究通過車輪式混溶的方法區分了所有樣本的基因型。再現性實驗也顯示，所有核酸提取方法及SNP位點對應的熔解曲線Tm值的CV均在0.4%～1.5%，盡管批間的熔解曲線有輕微的波動，但不影響基因正確分型。

3 討 論

HRM技術和其他SNP基因分型方法(限制性片段長度多態性法、Taqman熒光探針法等)相比，不需要設計序列特異度探針，不需要PCR后處理，全程閉關操作，減少了污染的風險，同時還具有檢測高效快速、靈敏度高、操作簡單、檢測費用低廉等優點[13]。但影響HRM檢測結果準確性的因素很多[14]，除PCR本身反應體系外，往往忽視標本核酸模板提取對結果的影響，且較少系統評價其對檢驗性能的影響。目前，僅有少量文獻報道運用磁性納米顆粒提取基因組DNA，同時，市面上所銷售的磁珠法核酸分離試劑盒，大多數為國外產品，價格昂貴，很難得到廣泛應用[15]。本研究對3種自建的基于磁珠法的PCR-HRM檢測系統進行了方法學的性能評價，結果顯示，與測序法比較，該方法的對3個位點(rs12641369G>A、rs3114018C>A、rs2302515C>G)分型的靈敏度和特異度均達到100%。2例樣本在檢測時存在擴增曲線異常偏離群體，原因可能與模板操作失誤或模板質量有關。重復性與再現性結果表明離心柱法與磁珠法結合PCR-HRM進行基因分型均具有較好的批內精密度，特別是G>A及C>A突變類型能夠通過熔解曲線峰型清楚地區分野生型與純合突變型。盡管不同修飾的磁珠提取效果各有差異，但HRM技術對檢測模板質量的輕微波動可以耐受，在檢測過程中仍可保證檢測結果的準確性及穩定性。

4 結 論

本研究制備的3種磁性納米顆粒(SiO2@Fe3O4、CTA@Fe3O4、Fe3O4)均可用于核酸提取及PCR-HRM檢測，但在提取核酸得率及檢驗性能方面，SiO2@Fe3O4更佳；磁珠提取結合PCR-HRM方法的建立有效縮短了實驗時間，提高了實驗效率，節省了工作成本，為后續的分子生物學研究提供了理論依據。另外，本研究所制備的磁珠有望實現自動化核酸提取，從而降低手工操作帶來的污染及誤差。