肝纖維化指標(biāo)與miRNA-200b、TAP聯(lián)合檢測(cè)與原發(fā)性肝癌預(yù)后的相關(guān)性研究

李章勇，夏 川，李剛勇，顏 彥，林應(yīng)標(biāo)△

(湖南省郴州市第一人民醫(yī)院，1.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心；2.肝病科，湖南郴州 423000)

原發(fā)性肝癌是目前我國(guó)最為常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，具有較高的致死率，全球范圍內(nèi)發(fā)病率均較高[1]。且原發(fā)性肝癌患者在發(fā)病早期缺乏典型的臨床癥狀，往往確診時(shí)已進(jìn)入中晚期，臨床治療難度較大，預(yù)后多不良[2]。因此，對(duì)于原發(fā)性肝癌患者及早確診、及早治療在改善患者預(yù)后、提高生存率方面具有重要意義。MiR-200家族作為miRNA的重要組成部分之一，在多種腫瘤組織中均有異常表達(dá)，尤其是miR-200家族是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3-4]。miR-200b為miR-200家族的重要成員，亦參與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為[5]。最近發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞惡變時(shí)，細(xì)胞膜表面的聚糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最常見(jiàn)的是N-鏈聚糖分支的增加，產(chǎn)生多種異常糖鏈糖蛋白即腫瘤異常蛋白(TAP)，可釋放到體液中。當(dāng)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的TAP量達(dá)到一定程度時(shí)，即可以在末梢血液中檢出[6]。亦有研究認(rèn)為肝臟纖維化病情進(jìn)展，最終可導(dǎo)致原發(fā)性肝癌。在此背景下，本研究旨在探討miRNA-200b、TAP蛋白表達(dá)水平與肝纖維化指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)在原發(fā)性肝癌疾病診斷中的意義，為臨床做好原發(fā)性肝癌早期診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年2月至2018年1月在本院接受治療的73例原發(fā)性肝癌患者病例資料作為研究對(duì)象，其中有男58例，女15例，年齡23～79歲，平均(57.11±8.32)歲。根據(jù)預(yù)后情況將患者分為預(yù)后良好組和預(yù)后不良組，以隨訪2年內(nèi)復(fù)發(fā)或死亡為預(yù)后不良組，隨訪期間未發(fā)生病情惡化為預(yù)后良好組。結(jié)果預(yù)后良好患者45例，其中男37例，女8例，年齡23～76歲，平均(58.06±7.41)歲。預(yù)后不良患者38例，男31例，女7例，年齡24～79歲，平均(57.34±6.27)歲。兩組患者性別比例、年齡等基礎(chǔ)資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組患者及家屬均對(duì)本研究方案之前同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專業(yè)委員會(huì)修訂的肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)樣本采集前未經(jīng)過(guò)放療、化療或介入治療等措施。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有自身免疫性疾病的患者；(2)伴有其他系統(tǒng)惡性腫瘤者。

1.3觀察指標(biāo)及方法

1.3.1標(biāo)本采集 入組研究者均使用真空采血管采集空腹靜脈血4 mL，室溫自然凝集30 min，室溫，4 000 r/min離心15 min，離心半徑16 cm，移取上層血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2miRNA-200b mRNA檢測(cè) 術(shù)中采集肝組織標(biāo)本，放入液氮中冷凍，之后轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱保存。取肝癌及癌旁組織標(biāo)本，研磨，采用TRIzol試劑盒提取組織中總RNA。所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并對(duì)獲得的總RNA進(jìn)行檢測(cè)，取A260/A280>1.8的標(biāo)本完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，之后采用RT-qPCR測(cè)定肝癌組織中miRNA-200b mRNA的表達(dá)水平。

1.3.3TAP的檢測(cè) 取各組研究對(duì)象指端末梢血，推制成厚薄均勻的血片3張，自然干燥。將TAP檢測(cè)試劑充分搖勻，用滴管垂直滴加在血片上，每張3滴；等血片上凝聚助劑自然干燥形成圓形“斑點(diǎn)”，將標(biāo)本置于TAP集成閱片儀下，尋找特異形態(tài)的凝聚物。TAP正常/無(wú)明顯凝聚物：面積0～121 μm2；TAP異常/凝聚物較小：面積121～225 μm2；TAP異常/凝聚物較大：面積≥225 μm2。試劑和儀器均購(gòu)自浙江瑞生醫(yī)療科技有限公司。

1.3.4肝臟纖維化指標(biāo) 測(cè)定儀器為新產(chǎn)業(yè)MAGLUMIN 2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀,試劑盒由深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司提供,檢測(cè)入組研究人群血清透明質(zhì)酸(HA)，Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、層粘連蛋白(LN)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用EXCEL軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的錄入和預(yù)處理，采用SPSS 22.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，采用Spearman相關(guān)性分析肝纖維化指標(biāo)及血清TAP，癌組織miRNA-200b與預(yù)后的相關(guān)性，預(yù)后良好賦值為1，預(yù)后不良賦值為0，并采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達(dá)水平與肝纖維化指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)在原發(fā)性肝癌預(yù)后的評(píng)估價(jià)值，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA比較 預(yù)后不良組患者肝組織miRNA-200b mRNA表達(dá)量均低于預(yù)后良好組，預(yù)后良好組患者血清TAP顯著高于預(yù)后不良組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者血清TAP、癌組織miRNA-200b水平比較

2.2兩組患者肝臟纖維指標(biāo)比較 觀察組患者血清 PCⅢ、Ⅳ-C、LN以及HA水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達(dá)水平及肝纖維化指標(biāo)與預(yù)后的相關(guān)性分析 如表3所示，血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達(dá)水平對(duì)原發(fā)性肝癌診斷的臨界值分別為0.58和94.02 μm2(r=-0.213、0.715，P<0.05)。肝纖維化指標(biāo)PCⅢ、Ⅳ-C、LN和HA對(duì)原發(fā)性肝癌診斷的臨界值分別為102.3 μg/L、98.1 μg/L、122.4 μg/L和106.5 μg/L(r=-0.512、-0.608、-0.743、-0.673，P<0.05)。

表2 兩組患者肝臟纖維指標(biāo)比較

2.4血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達(dá)水平與肝纖維化指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)在原發(fā)性肝癌預(yù)后的ROC曲線分析 血清血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達(dá)水平與肝纖維化指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)評(píng)估原發(fā)性肝癌預(yù)后的靈敏度、準(zhǔn)確度和特異度分別為0.985、0.972和0.832。見(jiàn)表3、圖1。

表3 血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達(dá)水平與

圖1 血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達(dá)

3 討 論

近年來(lái)，有研究表明腫瘤的生物學(xué)行為受到腫瘤自身及腫瘤微環(huán)境的影響，對(duì)其演變和轉(zhuǎn)歸均會(huì)產(chǎn)生重要影響[8-10]。趨化因子能夠?qū)C(jī)體免疫細(xì)胞募集至腫瘤病灶處，分泌多種細(xì)胞因子，影響腫瘤的生長(zhǎng)及附近血管的生成[11]。有大量報(bào)道表明，TAP與多種腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且能夠?qū)δ[瘤患者的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估[12-15]。

本研究結(jié)果表明，預(yù)后不良組患者血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組。相關(guān)研究表明miRNA-200b mRNA高表達(dá)者中位生存期長(zhǎng)于低表達(dá)者，表明miRNA-200b mRNA高表達(dá)可提高患者生存率，延長(zhǎng)生存期，與楊西勝等[16]報(bào)道基本一致。推測(cè) miRNA-200b mRNA在肝癌發(fā)生中可能發(fā)揮抑癌基因作用，高表達(dá)miRNA-200b mRNA可能通過(guò)下調(diào)E-cadherin 或直接抑制EMT而減少腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲的發(fā)生。

TAP是腫瘤細(xì)胞在新陳代謝過(guò)程中排放的糖蛋白和鈣-組蛋白復(fù)合物的總稱，TAP的出現(xiàn)間接表示細(xì)胞癌變的數(shù)量和程度。當(dāng)TAP達(dá)到一定程度后，這類物質(zhì)向血液排放，并較多地存在于外周血液。TAP在肝臟腫瘤具有較高表達(dá)，陽(yáng)性率為70%～95%[17]。將其作為肝癌血清學(xué)檢測(cè)的指標(biāo)，對(duì)發(fā)現(xiàn)癌前病變有較高的靈敏度和特異度。

正常肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分有蛋白多糖、LN和膠原。HA，一種蛋白多糖，在肝組織發(fā)生纖維化時(shí)，其在血清中的含量會(huì)明顯升高，同時(shí)分布于內(nèi)皮細(xì)胞的HA受體會(huì)相應(yīng)降低，其降解途徑受到抑制，因此在肝臟發(fā)生纖維化時(shí)，血清HA水平發(fā)生較大波動(dòng)，是目前能夠反映肝臟纖維化較為敏感的生化指標(biāo)之一[18]。慢性肝炎患者的血清PCⅢ持續(xù)升高提示病情向肝硬化發(fā)生了進(jìn)一步的進(jìn)展，而其血清含量的降低則預(yù)示了病情有所緩解。此外，LN及Ⅳ-C也是反映肝纖維化的重要指標(biāo)。隨著肝炎患者病情進(jìn)展，逐漸演變成肝硬化乃至肝癌，肝纖維化指標(biāo)均會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，因此肝纖維化指標(biāo)是反映機(jī)體肝臟健康狀況的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，預(yù)后不良組患者血清PCⅢ、Ⅳ-C、LN以及HA水平均低于預(yù)后良好組，說(shuō)明肝癌患者的預(yù)后與肝纖維指標(biāo)存在較好的相關(guān)性。

根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果，結(jié)果表明血清血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達(dá)水平與肝纖維化指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)原發(fā)性肝癌疾病預(yù)后評(píng)估的靈敏度、準(zhǔn)確度和特異度分別為0.985、0.972和0.832。說(shuō)明血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達(dá)水平聯(lián)合肝纖維化指標(biāo)能夠?qū)υl(fā)性肝癌進(jìn)行有效診斷，其原因是血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達(dá)水平作為在肝癌發(fā)生過(guò)程中即會(huì)明顯變化的指標(biāo)，用其預(yù)測(cè)肝臟疾病預(yù)后具有一定的臨床意義，而肝纖維化是肝臟病變逐漸進(jìn)展接近肝癌的一個(gè)病理期，因此兩種指標(biāo)聯(lián)合能夠兼顧特異度和準(zhǔn)確性。

4 結(jié) 論

血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達(dá)水平與肝纖維化指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)可用于對(duì)原發(fā)性肝癌的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估診斷，其靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度均較高，具有較好的臨床應(yīng)用前景。