細胞因子IL-6、TNF-α和循環腫瘤細胞在乳腺癌預后監測中的臨床意義

鄒 麟，向 瑜，李秋錦

(重慶醫科大學附屬第一醫院檢驗科，重慶 400016)

乳腺癌是發生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，是女性最常見的腫瘤之一,全球每年約40萬女性死于該病[1]。乳腺癌的發生和發展是內分泌、免疫系統等諸多因素共同作用的結果，一般要經歷從增生到非典型增生再到原位癌，最終發展為浸潤性癌[2]。目前手術仍是乳腺癌治療的主要手段，但是術后仍有將近60%患者發生復發轉移，而復發轉移是導致乳腺癌患者預后差的主要原因[3]。因此提高乳腺癌患者術后生存期，對乳腺癌預后情況的判斷就尤為重要。

目前，臨床上用于監測乳腺癌的預后指標有很多，如原發腫瘤的大小、受侵腋窩淋巴結個數、腫瘤的組織學、雌激素受體(ER)及孕激素受體(PR)、Her-2基因的擴增、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、循環腫瘤細胞(CTC)等。

IL-6是由內皮細胞和正常造血細胞等多種細胞產生的多效性細胞因子，具有促進生長和抗凋亡的作用。已有研究證實，IL-6在腫瘤患者血清內高度地表達并與患者預后較差相關[4]。TNF-α是一種具有抗腫瘤作用的細胞因子，其高水平的表達與乳腺癌的分級相關。CTC是指存在于外周血中的各類腫瘤細胞的統稱，它來源于原發腫瘤或轉移腫瘤，是獲得脫離基底膜的能力并入侵通過組織基質進入血管的腫瘤細胞，已有研究發現CTC是了解乳腺癌發病機制和監測乳腺癌進展及預后的指標[5]。

本研究擬通過檢測乳腺癌患者手術前后血清內IL-6、TNF-α水平及全血中CTC的表達數量，以確定其作為監測乳腺癌患者預后指標的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014-2015年在本院乳腺外科接受手術治療的乳腺癌患者61例，年齡31～63歲，平均年齡43.8歲。所有病例均符合世界衛生組織(WHO)乳腺癌的診斷標準，按照TNM臨床分期均為Ⅰ期。其中進行免疫組化染色[免疫組化指標包括人表皮生長因子受體Ⅱ型中分化群內的基因蛋白(CerbB-2)、ER、PR、抑癌基因(P53)、腫瘤增殖抗原(Ki67)]38例。通過上述免疫組化指標的陽性情況將38例乳腺癌患者分為全陽性組和非全陽性組。

1.2方法

1.2.1標本采集 在61例乳腺癌患者手術前以及手術后(24 h內)分別抽取患者外周靜脈血2～3 mL用于細胞因子的檢測,另抽取患者外周靜脈血8～10 mL于加有防腐劑的CellSave血樣本儲存管中用于CTC的檢測。

1.2.2細胞因子水平的檢測 用IMMULITE 1000化學發光分析儀(西門子公司)及其試劑盒(化學發光法)測定血清樣本中IL-6和TNF-α水平，實驗方法按照說明書進行。

1.2.3CTC檢測 用CellSearch檢測系統按照CellSearch循環上皮細胞檢測試劑盒(免疫磁顆粒細胞捕獲+熒光染色法，強生醫療器材有限公司)進行全血中的上皮源性的CTC的計數檢測。將7.5 mL血樣從CellSave血樣本儲存管移入帶標記的相應15 mL錐形試管中。加入6.5 mL的稀釋緩沖液，蓋上錐形試管的蓋子，上下顛倒5次混合均勻。在吊籃式離心機中，以800 g的相對離心力離心樣本10 min，離心過程關閉制動器。將上述制備好的樣本放入CellTracksAutoPrep系統中，CellTracksAutoPrep系統處理后的樣本轉移到樣本盒中，然后用CellTracks Analyzer分析儀進行分析。上皮細胞(CK-PE)特殊熒光試劑以及白細胞(CD45+)核染劑用于電腦制造細胞圖像，當形態學特征中包括腫瘤細胞特征并顯示出顯型EpCAM+,CK-PE+,DAPI+和CD45-時，圖像被分類為CTC。報告檢測的結果為：CTC的數目/7.5 mL的血液。

1.2.4免疫組化染色 免疫組化采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(SP)法，CerbB-2、ER、PR、Ki67試劑盒購自Ventana Medical Systems,Inc.，p53試劑盒購自福建邁新生物技術有限公司，按試劑盒操作步驟進行。以PBS取代一抗作為陰性對照，已知的CerbB-2、ER、PR、P53、Ki67陽性乳腺癌切片作為陽性對照。

1.3免疫組化染色結果及判定 ER、PR、P53、Ki67顯色在細胞核內呈現為棕色或棕黃色顆粒，CerbB-2則以胞漿和胞膜呈棕黃色為陽性。根據染色數量和染色強度綜合判斷，陽性細胞數低于10%為陰性，陽性細胞數高于10%為陽性。

1.4統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，數據為偏態分布，結果以M(P25、P75)表示。組間比較采用Wilcoxon(Mann-WhitneyU)檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1手術前后IL-6、TNF-α水平及CTC的數量比較 IL-6在術后水平升高，手術前后血清中IL-6水平差異有統計學意義(P<0.05)，而TNF-α水平及CTC的數量的差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 IL-6、TNF-α表達水平及CTC的數量在手術

2.2各免疫組化指標陽性率分析 61例乳腺癌患者中，進行免疫組化染色患者共計38例，其中CerbB-2陽性患者33例，陽性率87%；ER陽性患者27例，陽性率71%；PR陽性患者21例，陽性率55%，P53陽性患者21例，陽性率55%；Ki67>20% 20例，陽性率52%(Ki67>20%為高增殖活性，表中Ki67>20%即為Ki67陽性)。見表2。

表2 各免疫組化指標陽性率

2.3全陽性組/非全陽性組術前及術后IL-6、TNF-α水平及CTC數量比較 以免疫組化指標CerbB-2、ER、PR、P53、Ki67對38例乳腺癌患者進行分組，全陽性的11例患者為全陽性組，其余27例患者為非全陽性組，分別對手術前后免疫組化指標全陽性組和非全陽性組IL-6、TNF-α表達水平及CTC的數量進行比較。術前兩組IL-6、TNF-α表達水平及CTC的數量的差異均無統計學意義(P>0.05)，術后IL-6的表達水平在全陽性組表達升高，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，而TNF-α表達水平及CTC的數量在兩組中的差異無統計學意義(P>0.05)，見表3、4。

表3 術前IL-6、TNF-α表達水平及CTC的數量

表4 術后IL-6、TNF-α表達水平及CTC的數量

3 討 論

近年來乳腺癌發病率有升高趨勢，病死率居女性惡性腫瘤第2位,女性的身心健康受到嚴重威脅[6]。目前認為乳腺癌是由環境和遺傳等多種因素共同作用而導致的一種復雜疾病，但其發生、發展的機制仍不清楚，因此受到了臨床的高度關注。盡管乳腺癌可早發現、早診斷、早治療，包括手術、化療、放療、內分泌治療及生物靶向治療等，但仍有10%～15%的乳腺癌患者在手術后的2年內進展為晚期乳腺癌，5年生存率為21%[7]。乳腺癌術后一旦發生轉移，將不可治愈，因此尋找乳腺癌的預后監測指標至關重要。

目前用傳統的影像診斷、血清腫瘤標記物檢查等方法來判斷乳腺癌的預后，存在對微小轉移灶的早期檢出率低等缺點，而CTC可以早期發現微小轉移灶[8]。腫瘤的轉移程度與CTC陽性檢測呈正相關，治療前檢測CTC結果為陽性預示轉移性乳腺癌患者預后不良[9]。在本實驗中，術前組CTC個數平均數為1，術后組CTC個數平均數為2，兩組進行比較差異無統計學意義(P>0.05)。而CRISTOFANILI等[10]利用CellSearch系統對177例轉移性乳腺癌患者進行了前瞻性研究，發現治療前有CTC的患者無病進展生存期和總生存期均縮短。IGNATIADIS等[11]檢測444例乳腺癌患者外周血CTC并進行了隨訪，中位時間為53.5個月，結果顯示與CTC陰性患者相比，CTC陽性患者的局部復發率和遠處轉移率顯著升高，而無病生存期以及總生存期顯著縮短。本研究標本采集時間分別為術前24 h和術后24 h，CTC在外周血中的播散及消失是一個較長的過程，需要更長的時間，在術前、術后24 h內并沒有顯著的變化。本研究只針對患者手術前后的CTC的數量進行分析，并沒有在手術后對患者進行隨訪，沒有了解到患者術后的轉移復發情況，不能對術后復發轉移的患者及預后良好的患者CTC個數進行比較分析，所以后續實驗需要跟進了解患者術后的預后情況，從而做出更全面的判斷。

乳腺癌的形成是一個復雜的過程，包括細胞增殖分化侵襲、凋亡的紊亂、腫瘤基質和腫瘤周圍血管及腫瘤微環境形成等多個方面，而這些方面又受到各種因子的調控，其中細胞因子起到了非常重要的作用。有文獻報道腫瘤手術后大量炎癥細胞因子釋放，促進組織損傷修復，同時也是腫瘤復發的風險因素[12]。IL-6是主要由淋巴細胞、激活的巨噬細胞和血管內皮細胞產生，可促進炎癥介質釋放，它既能調節T淋巴細胞、B淋巴細胞和單核-巨噬細胞的免疫活性，又參與某些免疫病理的發生[13]。TNF-α是由單核巨噬細胞所產生的參與多種生理和免疫過程的重要介質。作為炎癥環境的中心調節因子，之前的研究認為TNF-α可直接進入腫瘤殺死癌細胞，但近年來不少的研究認為腫瘤微環境中TNF-α的長期表達可導致腫瘤細胞進一步惡化[14]。TNF-α促進上皮細胞類型的乳腺癌細胞轉為間充質干細胞類型，增強了入侵性和轉移性。因此，細胞因子IL-6和TNF-α與乳腺癌預后相關。

本研究結果顯示，IL-6水平：術前組為2.0(2.0，2.5)，術后組為8.5(5.4，13.6)，術后組IL-6的表達水平升高，兩組比較，IL-6的表達差異有統計學意義(P<0.05)。患者手術后IL-6水平顯著高于術前，則提示患者可能預后差。已有文獻證實IL-6與乳腺癌臨床分期、轉移復發相關[15]。PIERCE等[16]研究證實：血清中的炎癥因子不僅為沒有發生復發和轉移的乳腺癌患者提供早期的疾病復發風險的信息，還可以為評估乳腺癌復發風險提供新的策略。他們的研究結果與本研究相符。已有文獻報道，免疫組化指標CerbB-2、ER、PR、P53、Ki67與乳腺癌的預后有關，這些指標陽性提示患者預后差[17-20]。在患者術后，全陽性組IL-6水平為16.5(10.2，20.7)，非全陽性組IL-6水平為7.2(4.4，10.7)，全陽組IL-6的表達水平升高，兩組比較，IL-6表達差異有統計學意義(P<0.05)。全陽性組IL-6水平明顯高于非全陽性組，而免疫組化指標全陽性組預后不良，因此患者術后血清中IL-6水平高可能與患者預后差相關。

在體內，腫瘤細胞內源性TNF-α通過誘導惡性乳腺上皮細胞等腫瘤細胞增殖，并促進血管再生、腫瘤細胞侵襲和轉移等從而促進腫瘤發展[21]。TNF-α可作為腫瘤復發轉移的重要標記物并且能鑒定腫瘤預后。本研究結果是：術前組TNF-α水平為5.7(4.6，7.2)，術后組為5.2(4.6，7.3)，兩組TNF-α表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。因此本研究無法確定TNF-α水平是否可作為乳腺癌預后監測的指標。上述文獻中所選研究對象有近300例，而本研究對象為61例，不能完整反映TNF-α水平變化情況。后續實驗需要對患者進行隨訪，了解其預后情況，并對其血清中TNF-α水平進行監測，從而更全面了解TNF-α在乳腺癌患者預后監測中的作用。

4 結 論

乳腺癌患者手術后血清中IL-6水平顯著高于手術前，并且免疫指標CerbB-2、ER、PR、P53、Ki67全陽性患者的血清中IL-6水平顯著高于非全陽性組。因此，乳腺癌患者血清中IL-6的高水平與乳腺癌預后差相關。