自身抗體檢測(cè)現(xiàn)狀及展望

武永康,張乃丹 綜述，翟建昭 審校

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科,四川成都 610041;2.德陽市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川德陽 618000)

自身抗體是指針對(duì)自身組織、器官、細(xì)胞、細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)、體內(nèi)蛋白分子、體內(nèi)核酸等所有自身抗原的抗體總稱，其本質(zhì)為機(jī)體B細(xì)胞分泌的免疫球蛋白[1]。自身抗體分為生理性自身抗體(或稱天然自身抗體)(NAbs)和病理性自身抗體(PABs)。有研究顯示，生理性自身抗體是維持機(jī)體處于健康狀態(tài)的重要物質(zhì)，多為IgM型，參與機(jī)體正常新陳代謝，減少體內(nèi)細(xì)胞凋亡物質(zhì)的堆積[2]。當(dāng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能受損時(shí)，體內(nèi)自身抗體大量產(chǎn)生，多為IgG型，與自身抗原親和力高，形成的免疫復(fù)合物通過FcγR激活炎性介質(zhì)(細(xì)胞因子)或補(bǔ)體系統(tǒng)，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生，這種具有致病損傷作用的自身抗體即為病理性自身抗體，即通常所稱的自身抗體[3]。

1 自身抗體的種類

自身抗體種類很多，通常采用兩種分類方法，一種為以疾病為中心，即相關(guān)自身抗體與該疾病有關(guān)，該分類法對(duì)于臨床醫(yī)生自身抗體項(xiàng)目申請(qǐng)具有重要意義，同時(shí)也有助于對(duì)該疾病與自身抗體的全面認(rèn)識(shí)；另一種為以靶抗原為中心，即其命名為抗靶抗原抗體，這有助于對(duì)自身抗體性質(zhì)的認(rèn)識(shí)，也有助于對(duì)自身抗體對(duì)靶向組織攻擊造成機(jī)體損傷的理解。從理論上講，機(jī)體內(nèi)存在多少種抗原，就能產(chǎn)生多少種自身抗體，因此，自身抗體錯(cuò)綜復(fù)雜，種類可達(dá)成千上萬種，自身抗體的命名應(yīng)盡量根據(jù)抗體所針對(duì)的抗原進(jìn)行，便于名稱的統(tǒng)一。以靶抗原為中心的自身抗體分類見圖1。

1.1常規(guī)自身抗體 隨著自身免疫學(xué)科的發(fā)展及檢驗(yàn)技術(shù)的逐漸普及，自身抗體已成為大多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，包括抗核抗體(ANA),抗核抗體譜[包括抗DNA、抗組蛋白及抗可提取性核抗原(ENA)抗體譜等]，抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體[包括抗蛋白酶3抗體(抗PR3)、抗髓過氧化酶抗體(抗MPO)等]，抗磷脂抗體(包括抗心磷脂抗體、抗β2糖蛋白I抗體、抗磷脂酰絲氨酸抗體等)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗體(包括抗CCP抗體、類風(fēng)濕因子、抗角蛋白抗體等)，自身免疫肝病抗體(包括抗平滑肌抗體、抗線粒體抗體、抗肝腎微粒體-1抗體等)，肌炎相關(guān)抗體(包括抗Mi-2、抗信號(hào)識(shí)別顆粒抗體、抗PM-Scl100等)，糖尿病抗體(包括谷氨酸脫羧酶抗體、胰島素抗體和胰島細(xì)胞抗體等)。其中ANA與抗核抗體譜是臨床開展最為普遍的兩類項(xiàng)目。ANA泛指抗各種核及胞漿抗原成分的一大類抗體，推薦采用以HEp-2細(xì)胞為底物的間接免疫熒光法進(jìn)行檢測(cè)。而抗核抗體譜是指針對(duì)明確純化抗原抗體的集合，其與傳統(tǒng)的ENA抗體譜有所不同，傳統(tǒng)ENA抗體譜檢測(cè)通常采用磷酸鹽緩沖液提取動(dòng)物胸腺細(xì)胞核蛋白作為抗原底物[4]。但由于核成分中的DNA和組蛋白等堿性成分無法被磷酸鹽緩沖液(pH=7.2)提取，因此，傳統(tǒng)ENA抗體譜并未包括抗DNA抗體和組蛋白抗體等堿性靶抗原的抗體。

隨著蛋白重組技術(shù)的進(jìn)步，幾乎所有蛋白分子均可重組合成，目前臨床上很少采用傳統(tǒng)Western-blot法進(jìn)行ENA抗體譜的檢測(cè)，從理論上講，合成純化抗原檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可信，且抗核抗體譜的檢測(cè)范圍遠(yuǎn)大于ENA抗體譜的范圍。ENA抗體譜概念不再被使用，因此，采用大量重組蛋白的抗核抗體譜檢測(cè)試劑盒在臨床上已趨普及，并被廣大學(xué)者所接受。ANA熒光圖型與抗核抗體譜靶抗原對(duì)應(yīng)關(guān)系見圖2。

圖1 以靶抗原為中心的自身抗體命名分類圖

1.2新型自身抗體 隨著蛋白重組及自身抗體篩選技術(shù)的發(fā)展，大量新型自身抗體集中涌現(xiàn)，其中主要包括傳統(tǒng)自身免疫疾病發(fā)現(xiàn)的一些自身抗體，另外在其他領(lǐng)域如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、生殖、消化系統(tǒng)疾病等也出現(xiàn)了一些新型自身抗體，為其應(yīng)用拓展了范圍。腫瘤患者自身抗體反應(yīng)通常與腫瘤組織或血清中的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的異常或過度表達(dá)相關(guān)，大部分的腫瘤自身抗體都是由TAA誘導(dǎo)產(chǎn)生的，為腫瘤的診斷和鑒別診斷提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。近年來出現(xiàn)的新型自身抗體見表1。

圖2 ANA熒光圖型與抗核抗體譜靶抗原對(duì)應(yīng)關(guān)系

表1 近年來出現(xiàn)的新型自身抗體

2 自身抗體篩選和發(fā)現(xiàn)

新型自身抗體的發(fā)現(xiàn)對(duì)于疾病診斷和認(rèn)識(shí)具有重要意義。目前以HEp-2細(xì)胞為基質(zhì)的ANA檢測(cè)及以肝、腎組織為基質(zhì)的ANCA和GBM檢測(cè)已經(jīng)在臨床廣泛開展[21-22]，而臨床實(shí)踐過程中，相當(dāng)數(shù)量的醫(yī)師和技師只關(guān)注熟悉已知的熒光抗體模型，對(duì)于特殊少見熒光模型很多情況下都主觀認(rèn)為是非特異性染色或雜質(zhì)而忽略。實(shí)際上，臨床工作中遇到未知熒光抗體模型時(shí)應(yīng)做詳細(xì)記錄，并結(jié)合患者疾病或臨床癥狀進(jìn)行分析，從而可能發(fā)現(xiàn)新的熒光模型與疾病之間的關(guān)系，有利于新型自身抗體發(fā)現(xiàn)。

此外，傳統(tǒng)的Western-blot法也是發(fā)現(xiàn)新型自身抗體的檢測(cè)方法。由于ENA抗原蛋白分離帶非常多，臨床上會(huì)發(fā)現(xiàn)一些所謂的“雜帶”，這些雜帶可能就是與疾病相關(guān)的新型自身抗體，但臨床實(shí)踐中也常被忽略。目前，由于該法檢測(cè)ENA抗體譜的局限性，以及檢測(cè)結(jié)果的不確定性，Western-blot法檢測(cè)ENA抗體譜已很少使用，取而代之采用純化抗原的線性免疫印跡法、化學(xué)發(fā)光法或液相芯片技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

雖說上述兩種方法具有發(fā)現(xiàn)新型自身抗體的可能性，但熒光抗體檢測(cè)基質(zhì)及ENA提取物抗原種類有限，基質(zhì)并未包括人體所有的抗原物質(zhì)，這是發(fā)現(xiàn)新型自身抗體的內(nèi)在缺陷。目前已發(fā)展出一些高效篩選自身抗體的方法。

2.1重組cDNA 表達(dá)文庫的血清學(xué)分析(SEREX) SEREX技術(shù)是自身抗體篩選的重要手段，通過提取患者組織mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后導(dǎo)入噬菌體，并溶原性感染大腸桿菌構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫，將表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)印在硝酸纖維膜上，之后與患者血清反應(yīng)，然后對(duì)陽性克隆進(jìn)行PCR測(cè)序鑒定即可得知抗原種類，同時(shí)也選出相應(yīng)的自身抗體。

2.2噬菌體展示技術(shù) 噬菌體展示技術(shù)是將外源基因插入噬菌體衣殼蛋白基因，使外源蛋白表達(dá)在噬菌體表面，大量表達(dá)外源蛋白的單個(gè)噬菌體構(gòu)成噬菌體文庫,展示的蛋白和血清中IgG自身抗體反應(yīng)后，篩選陽性噬菌體并擴(kuò)增鑒定，并采用測(cè)序方式確定自身抗原。

2.3蛋白芯片技術(shù) 首先，納入一定數(shù)量的研究患者及匹配的對(duì)照，從而尋找患者與對(duì)照最為顯著差異表達(dá)的信號(hào)，之后將選定的差異自身抗體在大范圍患者確認(rèn)，以確定選定自身抗體診斷疾病的有效性。目前，眾多學(xué)者已嘗試采用約20 000個(gè)重組人蛋白的芯片，系統(tǒng)性地發(fā)現(xiàn)免疫相關(guān)疾病及腫瘤的自身抗體[23]。

3 自身抗體檢測(cè)新技術(shù)

二十世紀(jì)50年代中期至80年代后期的30余年間，自身抗體的檢測(cè)方法主要有間接免疫熒光法、放射免疫法、被動(dòng)血凝法、顆粒凝集法、對(duì)流免疫電泳法、免疫雙擴(kuò)散法、放射免疫沉淀法、免疫印跡法等，主要從細(xì)胞及蛋白多肽水平認(rèn)識(shí)自身抗體。對(duì)于上述檢測(cè)方法而言，鑒于間接免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果的直觀性、自身抗體檢測(cè)的廣泛性，在今后一段時(shí)間內(nèi)，該方法仍將是不可替代的篩選檢測(cè)方法。

上述自身抗體檢測(cè)方法多為半定量的方法，難以標(biāo)準(zhǔn)化，使疾病診斷的特異度、靈敏度受到限制。上世紀(jì)90年代后，隨著純化靶抗原技術(shù)的進(jìn)步，試劑廠商采用純化抗原制作試劑，提高了自身抗體的檢測(cè)速度和準(zhǔn)確性。自身抗體的檢測(cè)主要朝2個(gè)方向發(fā)展，即多個(gè)自身抗體同時(shí)檢測(cè)的高精度、高通量檢測(cè)方法的液相芯片技術(shù)(又稱多元流式點(diǎn)陣儀)和單項(xiàng)自身抗體精確檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光法。兩種檢測(cè)方法均為高精度、全自動(dòng)化大型檢測(cè)儀器，但其各有特點(diǎn)，前者一次檢測(cè)項(xiàng)目最多達(dá)100多項(xiàng)，但其必須組合項(xiàng)目同時(shí)檢測(cè)，對(duì)于初診患者而言，確實(shí)可以通過多個(gè)疾病的自身抗體組合，很快檢測(cè)出相關(guān)疾病的自身抗體，但其醫(yī)療成本較高，對(duì)于確診患者，只需要檢測(cè)單個(gè)或數(shù)個(gè)曾檢測(cè)出的陽性自身抗體即可，這對(duì)于液相芯片而言，多項(xiàng)檢測(cè)將造成資源浪費(fèi)。隨著醫(yī)療改革的推進(jìn)，居民醫(yī)療將按疾病種類進(jìn)行保險(xiǎn)支付，可促使醫(yī)院及醫(yī)生進(jìn)行精確檢測(cè)節(jié)約醫(yī)療成本。若液相芯片單個(gè)檢測(cè)無法降低成本的情況下，化學(xué)發(fā)光法將顯示出其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可單個(gè)項(xiàng)目檢測(cè)，且成本可控，因此，試劑儀器生產(chǎn)商將會(huì)對(duì)檢測(cè)技術(shù)及檢測(cè)成本進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，讓臨床能夠得到更多、更好的選擇。

4 自身抗體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及共識(shí)

標(biāo)準(zhǔn)或共識(shí)是專家對(duì)現(xiàn)狀討論分析后的操作建議。自身抗體檢測(cè)共識(shí)的建立恰恰是因?yàn)樽陨砜贵w檢測(cè)不規(guī)范、不統(tǒng)一、結(jié)果可比性差的現(xiàn)實(shí)背景下達(dá)成的一致意見。行業(yè)協(xié)會(huì)為提高檢測(cè)質(zhì)量及結(jié)果可比性做出了不懈努力。到目前為止，主要有兩類常規(guī)自身抗體(ANA及ANCA)制定了部分規(guī)范。

4.1ANA檢測(cè)規(guī)范 2014年歐洲自身免疫標(biāo)準(zhǔn)化促進(jìn)會(huì)和自身抗體標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)共同發(fā)表了《抗核抗體檢測(cè)的國(guó)際建議》。2014年8月在第12屆自身抗體和自身免疫國(guó)際研討會(huì)議上，形成ANA熒光模型國(guó)際共識(shí)，提出關(guān)于ANA熒光模型標(biāo)準(zhǔn)化分類命名的國(guó)際共識(shí)。中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)風(fēng)濕免疫科醫(yī)師分會(huì)自身抗體檢測(cè)專業(yè)委員會(huì)于2018年在中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志上發(fā)表了中國(guó)ANA檢測(cè)共識(shí)[24]，主要建議包括：(1)推薦以HEp-2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)基質(zhì)的IIF法是進(jìn)行ANA檢測(cè)的參考方法和首選方法；(2)建議ANA檢測(cè)時(shí)，HEp-2細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)基質(zhì)中每顯微鏡視野(放大倍數(shù)為200倍)應(yīng)可見3～5個(gè)有絲分裂細(xì)胞；(3)二抗應(yīng)使用熒光素標(biāo)記的抗人IgG抗體；(4)IIF法檢測(cè)ANA的稀釋方法可根據(jù)不同的檢測(cè)試劑而采用倍比稀釋系統(tǒng)或根號(hào)10稀釋系統(tǒng)；(5)當(dāng)臨床高度疑診時(shí)，不論ANA總抗體的檢測(cè)結(jié)果如何，都需要對(duì)針對(duì)靶抗原的特異性自身抗體進(jìn)行檢測(cè)；(6)對(duì)ANA熒光模型做了相應(yīng)要求，必報(bào)熒光模型包括：均質(zhì)型、斑點(diǎn)型，細(xì)胞核致密斑點(diǎn)型、著絲點(diǎn)型、核點(diǎn)型、核仁型、胞漿顆粒型、線粒體型、高爾基體型、棒環(huán)狀型、核膜型，肌動(dòng)蛋白型。

4.2ANCA檢測(cè)規(guī)范 近年來發(fā)表了ANCA檢測(cè)共識(shí)[25-26]，其主要意見如下:(1)當(dāng)患者表現(xiàn)為腎小球腎炎(特別是快速進(jìn)展的腎小球腎炎)、有系統(tǒng)特征的皮膚型血管炎，多個(gè)肺結(jié)節(jié)、上呼吸道慢性破壞性疾病、長(zhǎng)期鼻竇炎或耳炎、聲門下氣管狹窄、多發(fā)性單神經(jīng)炎或其他周圍神經(jīng)病變、眶后腫塊、鞏膜炎等需檢測(cè)ANCA；(2)檢測(cè)抗MPO抗體、抗PR3抗體的高質(zhì)量方法應(yīng)作為ANCA的篩查實(shí)驗(yàn)；(3)若抗MPO抗體、抗PR3抗體陰性，但臨床高度懷疑小血管炎時(shí)，應(yīng)推薦到有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)；(4)抗MPO抗體、抗PR3抗體陰性時(shí)，不能排除腺相關(guān)病毒(AAV)；(5)抗MPO抗體、抗PR3抗體陽性有助于診斷AAV，但不能僅憑此診斷。

5 自身抗體檢測(cè)的問題及發(fā)展方向

自身抗體檢測(cè)結(jié)果在同質(zhì)化和結(jié)果互認(rèn)方面存在很大障礙，原因主要有以下兩個(gè)方面，第一為試劑溯源問題，目前關(guān)于抗原試劑性能評(píng)價(jià)并無可以溯源參比的國(guó)際組織，因此，檢測(cè)結(jié)果通常會(huì)出現(xiàn)抗體滴度強(qiáng)弱不等。當(dāng)廠商試劑對(duì)比檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)差異時(shí)，無法確定哪家試劑檢測(cè)準(zhǔn)確度較高，臨床通常采用檢測(cè)結(jié)果與臨床疾病診斷符合率進(jìn)行分析，這雖說是一種比較好的評(píng)價(jià)方法，但大多數(shù)自身免疫病的診斷標(biāo)準(zhǔn)多為多項(xiàng)指標(biāo)綜合判斷，患者疾病異質(zhì)性大，特別是要評(píng)價(jià)的自身抗體檢測(cè)指標(biāo)往往是輔助指標(biāo)，自身抗體在疾病預(yù)示價(jià)值方面存在缺陷，該指標(biāo)在增加靈敏度的同時(shí)必然會(huì)損失特異度，因此給臨床和實(shí)驗(yàn)室造成巨大困難，這將是今后自身抗體檢測(cè)面臨的最大問題。第二為實(shí)驗(yàn)操作問題，目前多數(shù)自身抗體檢測(cè)仍以手工操作或半自動(dòng)儀器檢測(cè)為主，檢測(cè)結(jié)果仍受檢測(cè)方法、檢驗(yàn)試劑、檢驗(yàn)儀器及實(shí)驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)性等諸多因素影響，特別是熒光抗體檢測(cè)受人為因素影響更大，包括熒光顯微鏡的質(zhì)量、技術(shù)人員對(duì)圖像的認(rèn)識(shí)、熒光強(qiáng)度的感知、視力的好壞等。目前已有醫(yī)院開始采用電腦圖像采集，然后通過觀察顯示器上圖像進(jìn)行結(jié)果判讀，這也帶來新的問題，如各公司圖像采集卡的質(zhì)量和參數(shù)不同，顯示器分辨率及顯卡質(zhì)量等存在很大差異，同一圖像在不同條件下可以得出完全不同的結(jié)果，這一點(diǎn)值得實(shí)驗(yàn)室工作人員注意。

不久的將來，自身抗體檢測(cè)將迎來短期粗獷的發(fā)展和長(zhǎng)期規(guī)范的調(diào)整。隨著自身抗體篩選新技術(shù)的廣泛應(yīng)用，將篩選出與各系統(tǒng)疾病有關(guān)的新型自身抗體，對(duì)于疾病診斷、鑒別診斷及發(fā)病機(jī)制的研究將提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，為了更好地將自身抗體檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用于臨床，并達(dá)到結(jié)果互認(rèn)，建議國(guó)際國(guó)內(nèi)行業(yè)協(xié)會(huì)等部門牽頭制訂試劑溯源及標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)范，從頂層設(shè)計(jì)或行業(yè)強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)的高度規(guī)范自身抗體檢驗(yàn)的試劑生產(chǎn)商、檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室及臨床醫(yī)生應(yīng)用行為。從發(fā)展的角度而言，自身抗體檢測(cè)最終將實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化、高通量、標(biāo)準(zhǔn)化和人工智能，從而顯著提高自身抗體檢測(cè)質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果互認(rèn)，提高實(shí)驗(yàn)室臨床服務(wù)能力。