新疆塔城地區傳統酸馬奶中Lactobacillus的分離鑒定及其耐藥譜分析

高璇 羅寶龍 張艷

摘要 [目的]通過對新疆塔城地區傳統發酵酸馬奶中Lactobacillus的分離鑒定和耐藥譜分析，確定乳桿菌組成及其安全性。[方法]采用梯度稀釋涂平板法分離，結合生理生化、屬引物和16S rRNA基因擴增進行鑒定。[結果]從7份傳統酸馬奶中鑒定得到20株乳桿菌，L.plantarum為優勢種。所有菌株對萬古霉素具有耐受性，多重耐藥菌株占85%。[結論]傳統酸馬奶中蘊含優良的微生物菌種資源，值得進一步研發和保護。

關鍵詞 酸馬奶;乳桿菌;鑒定;耐藥譜

中圖分類號 TS207.3文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）10-0144-03

Abstract [Objective] The composition and safety of Lactobacillus were determined by the isolation，identification and drug resistance spectrum analysis of Lactobacillus in traditional fermented koumiss in Tacheng area of Xinjiang.[Methods]The Lactobacillus were separated by gradient dilution coating plate method and combined with physiological and biochemical test， genusspecific primers amplification， and 16S rRNA gene amplification.[Results] Twenty strains of Lactobacillus were isolated from 7 samples， and L. plantarum was the dominant species. All strains were resistant to vancomycin， and multidrug resistant strains accounted for 85%. [Conclusion] Traditional fermented koumiss contains excellent microbial resources and is worthy of further research and development.

Key words Koumiss;Lactobacillus;Identification;Drug resistant spectrum

我國新疆塔城地區哈薩克族、維吾爾族、蒙古族等少數民族具有悠久的游牧歷史，擁有眾多具有民族特色的傳統乳品。其中，傳統酸馬奶因其特有風味、口感及豐富的營養和保健作用，深受人們喜愛。傳統的酸馬奶通常是在夏天將剛擠出的新鮮馬奶倒入皮囊中，加入適量自留的發酵引子，攪拌均勻后密封、保溫存放，每天不定時的攪拌，發酵數日即可[1]。這種傳統的發酵過程在酸馬奶中自然的篩選、富集了具有地理、環境、氣候、民俗等特征的土著性微生物，為工業化生產發酵乳制品及益生菌產品提供了寶貴的菌種資源[2]。然而，受牧區衛生條件的限制，人、畜常用的青霉素、卡那霉素、萬古霉素等抗生素藥殘在水體、排泄物、土壤之間循環，產生了獲得性耐藥微生物，引起了微生物的耐藥基因不斷傳播和富集，對人類臨床疾病的治療和傳統發酵乳品的安全性造成了很大的影響[3]。因此，優良微生物資源的開發及其安全性評估顯得非常有必要。該研究通過對新疆塔城地區傳統酸馬奶樣品中乳桿菌的分離、鑒定及其菌株耐藥譜分析，為乳桿菌資源的開發和乳品生物安全性評估提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

7份傳統酸馬奶樣品采集自額敏縣（Em）、和布克賽爾縣（Hb）、塔城市（Tc）、托里縣（Tl）;乳酸桿菌選擇性瓊脂（LSA）、MRS培養基生物純試劑購自青島

海博生物技術有限公司;Pre-Mix購自TaKaRa公司;PCR引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成;抗生素紙片（氯霉素，C30;環丙沙星，CIP5;慶大霉素，CN10;紅霉素，E15;卡那霉素，K30;新霉素，N30;青霉素G，P10;利福平，RD5;鏈霉素，S10;四環素，TE30;萬古霉素，VA30）為英國的Oxoid;其余分析純試劑購自天津市化學試劑三廠。模式菌株為L.plantarum CGMCC1.7487、L.raffinolactis CGMCC1.1935、L.casei CGMCC1.575。

1.2 儀器與設備

PCR儀為德國Biometra公司Tprofessional;凝膠成像系統為法國Vilber多功能成像系統;水平電泳儀為美國Bio-Rad公司PowerPac Universal。

1.3 方法

1.3.1 分離純化。

移取10 mL樣品于90 mL無菌生理鹽水，振蕩混勻。采用梯度稀釋法，取10-2、10-3、10-4各100 μL分別在LSA、MRS培養基上涂布，37 ℃培養48 h。根據菌落形態、顏色等表面特征差異隨機挑取10個不同的單菌落在相應的培養基上純化3次后接種至MRS肉湯37 ℃富集24 h，補充25%的滅菌甘油冷凍保藏在-80 ℃[4]。

1.3.2 初篩。

參考東秀珠等[5]的方法，純培養物通過革蘭氏染色和接觸媒試驗的初步篩選，將篩選到的G+、接觸酶陰性、細胞形態為桿狀的菌株作為疑似乳桿菌進一步鑒定。

1.3.3 菌株屬水平PCR擴增。

參考Justé等[6]的方法提取初篩菌株的基因組DNA保存于-20 ℃。

參考文獻[7]，選用乳桿菌屬特異性引物LbLMA1-rev（5'-CTTGAGAGTTTGATCCTGG-3'）、R16-1（5'-CTCAAAACTAAACAAAGTTTC-3'）進行擴增，以標準菌株作為陽性對照，目標片段大小約200 bp。其PCR擴增體系：Pre-Mix 12.5 μL，引物（20 μmol/L）各1 μL，DNA約50 ng，ddH2O補足25 μL。擴增產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，4.5 V/cm電泳1.5 h，使用Vilber多功能成像系統對電泳凝膠進行成像分析。

1.3.4 乳桿菌16S rRNA基因的系統進化分析。

將乳桿菌屬特異性PCR擴增結果呈陽性的菌株，采用細菌通用引物27F、1492R進行PCR擴增[8]。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由生工生物工程（上海）股份有限公司純化后進行測序。將測序結果進行BLAST在線分析，下載GenBank數據庫中同源性達到98%以上的基因序列，建立系統發育樹。用ClustalX 1.83軟件將序列進行排列[9]，用鄰接法neighbor-joining method計算進化距離，距離模型采用P-distances法和Kimura-2parameter雙參數法進行，進化樹分支模式的穩定性用MEGA 5.0[10]軟件分析，可靠性驗證采用Bootstrap法，重復次數為1 000。

1.3.5 耐藥譜。

參考賈麗艷[11]的方法，將篩選的乳桿菌培養至對數期，調整菌液濃度為（2.0～2.5）×108 CFU/mL，移取200 μL，用無菌棉簽將菌液涂布于MRS培養基。將抗生素紙片分別等距貼于平板上，37 ℃培養24 h，利用游標卡尺測定抑菌圈直徑。每種紙片3個平行，結果求平均值。參考臨床實驗室標準化協會（CLSI）制定的《抗微生物藥物敏感性試驗執行標準》分析菌株的耐藥性[12]。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離、初步鑒定

將7份樣品處理后從2種培養基中共分離到135株疑似乳桿菌純培養物。通過革蘭氏染色、鏡檢，篩選到59株細胞形態為桿狀、G+菌株，其中41株接觸媒試驗呈陰性。菌落顏色主要有乳白色、白色、乳黃色，菌落大部分中部凸起，表面濕潤。在液體富集時，培養基底部有沉淀，越靠上培養基越澄清，表明菌株嗜好低濃度氧的環境。

2.2 乳桿菌屬特異性PCR擴增

41株初步篩選的疑似乳桿菌經屬特異性引物PCR擴增后，擴增產物檢測結果呈陽性，條帶大小與模式菌株一致且符合目標片段的菌株共有20株（圖1）。

2.3 乳桿菌16S rRNA基因的系統進化分析

通過對20株菌株進行16S rRNA基因的擴增、測序后得到菌株序列，通過Blast工具在GenBank數據庫中與已發表的16S rRNA基因序列進行相似性比較，選取相似性在98%以上的序列構建系統發育樹（圖2），由系統發育樹可知20株菌株均為Lactobacillus，包括L.plantarum、L.fermentum、L.acidophilus、L.casei、L.paracasei共5個種。其中Hb1-M-6、Hb1-L-1、Hb3-M-7、Tc-L-10、Tl1-L-6、Tl2-M-7、Tl2-L-9、Tl2-M-6的序列與L.plantarum的相似性達100%;Hb1-M-1、Hb2-M-1、Hb2-L-4、Tc-L-6、Tl1-M-10的基因序列與L.fermentum的相似性高于98%;Hb1-M-5、Hb2-L-3、Hb3-M-4、Hb3-M-8與已知的L.acidophilus的相似性均達99%;Em-L-9、Tl1-L-3與L.casei的相似性為99%，Tl1-L-5與L.paracasei的序列相似性為100%。

2.4 耐藥譜

20株Lactobacillus對11種常用抗生素的耐藥性統計如圖3，所有菌株對萬古霉素（VA30）具有耐受性，16株乳桿菌對卡那霉素（K30）具有耐受性，所有菌株對利福平（RD5）敏感。85%的菌株表現為多重耐藥（MDR），耐受5、6種抗生素的菌株分別占35%、20%，菌株Tl1-L-3對7種抗生素具有耐受性。

3 討論與結論

近年來，土著性優勢微生物資源的開發受到國內廣大學者的關注，尤其以Lactobacillus、Bifidobacterium、Bacillus等益生菌為主。我國新疆具有悠久的游牧歷史，傳統的發酵乳品種類繁多，發酵制品中包含了大量的土著性微生物，是優良菌種研發的一個重要資源庫。該研究通過屬特異性引物PCR擴增，結合16S rRNA基因測序，從7份傳統酸馬奶中分離、鑒定得到20株乳桿菌，包括5個種。其中，植物乳桿菌為優勢菌種占40%，發酵乳桿菌和嗜酸乳桿菌分別為25%、20%，干酪乳桿菌分離到2株（10%），副干酪乳桿菌只有1株（5%）。孫天松等[13]的研究中瑞士乳桿菌為優勢種，其次為嗜酸乳桿菌;孟和畢力格等[14]從內蒙古采集的酸馬奶中干酪乳桿菌最多占32%，嗜酸乳桿菌占20%，植物乳桿菌8株占16%;張明珠[15]從烏魯木齊市郊采集的樣品中分離得到干酪乳桿菌占15.8%。相比發現，不同地區、不同研究中乳桿菌在種水平上的組成比例相差較大，這是由于地域、自然環境、季節等差異導致酸馬奶營養成分、發酵條件不同。同時，不同地區、家庭、民族的制作方法、發酵引子、衛生習慣存在很大差異，從而導致微生物組成存在差異[16]。

微生物菌株對抗生素的敏感性是篩選益生菌和發酵劑時需首要考慮的安全特性[17]。該研究從7份傳統酸馬奶樣品中分離的20株Lactobacillus均對萬古霉素耐藥，最多耐受7種抗生素，多重耐藥率達85%。大量的研究報道了乳桿菌對萬古霉素具有天然耐受性[18-19]，張愛民[20]、梁萌萌等[21]的研究結果與該研究較為接近。

新疆塔城地區傳統酸馬奶中Lactobacillus資源豐富，大量的菌株具有多重耐藥性，優良菌株的開發和保護迫在眉睫。

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