高效液相色譜法測(cè)定雙葛止瀉口服液中綠原酸的含量

周冰 李煥娟 楊會(huì)鮮

摘要 [目的]建立并驗(yàn)證雙葛止瀉口服液中綠原酸的含量測(cè)定方法。[方法]采用Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸水溶液梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm;流速為1.0 mL/min;柱溫為25 ℃。[結(jié)果]綠原酸進(jìn)樣量在0.082 5～0.825 0 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r = 0.999 9），平均回收率為104.0%，RSD為0.4%。[結(jié)論]該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于雙葛止瀉口服液中綠原酸的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 綠原酸;雙葛止瀉口服液;高效液相色譜法

中圖分類號(hào) R286文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）10-0167-03

Abstract [Objective] The method for determination of the content of chlorogenic acid in Shuangge antidiarrhea oral liquid was developed and validated. [Method] The analysis was performed on an Agilent ZORBAX SBC18 column（150 mm×4.6 mm， 5 μm）. The gradient mobile phase was consisted of acetonitrile -0.4% phosphoric acid solution， and the detection wavelength was 327 nm. The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 25 ℃. [Result] The linear range of the calibration curves for chlorogenic acid was 0.082 5-0.825 0 μg （r = 0.999 9）， and the average recovery was 104.0% with RSD of 0.4%. [Conclusion] The method is simple and accurate with high specificity， which can be used to determine the content of chlorogenic acid in Shuangge Antidiarrhea oral liquid.

Key words Chlorogenic acid;Shuangge antidiarrhea oral liquid;HPLC

雙葛止瀉口服液是由金銀花、葛根、黃芩等6味中藥采用現(xiàn)代提取工藝，經(jīng)離心純化，加入輔料，滅菌而制成的口服液制劑。臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，本方具有清熱燥濕、解毒止瀉的功效，可用于仔豬濕熱泄瀉。本方是在中醫(yī)古籍《傷寒論》中經(jīng)典方劑“葛根芩連湯”的基礎(chǔ)上，通過組方加減、工藝優(yōu)化、劑型改進(jìn)而制成的中獸藥制劑。金銀花為本方的君藥，性甘寒，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功能。現(xiàn)代研究表明，金銀花具有解熱、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗凝血等藥理作用，其中綠原酸是金銀花中的主要功效成分[1-5]。

由于該制劑為中獸藥復(fù)方新制劑，目前尚無質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為了更好地控制該制劑的質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜梯度洗脫法，建立雙葛止瀉口服液中綠原酸的含量測(cè)定方法，并對(duì)該方法進(jìn)行耐用性研究，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。Waters e2695型高效液相色譜儀，配2489型紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）;AB135-S型電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

1.1.2 試藥與試劑。綠原酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110753-201415，含量96.2%）、雙葛止瀉口服液（洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司，批號(hào)20170201、20170202、20170203，規(guī)格：每1 mL相當(dāng)于原生藥0.45 g）;乙腈，HPLC級(jí)，Thermo Fisher Scientific公司;磷酸，HPLC級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;水為超純水。

1.2 方法

1.2.1

色譜條件與系統(tǒng)適用性。色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150? mm× 4.6 mm，5 μm）;梯度洗脫，流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（0～12 min，乙腈11%;12～13 min，乙腈由11%上升至40%;13～18 min，乙腈40%;18～19 min，乙腈由40%下降至11%;19～25 min，乙腈11%），流速1.0 mL/min;柱溫25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm;進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1 000。

1.2.2 對(duì)照品貯備液的制備。取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得（10 ℃以下保存）。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備。精密吸取對(duì)照品貯備液5 mL，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，即得（10 ℃以下保存）。

1.2.4 供試品溶液的制備。精密量取本品2 mL，置50 mL容量瓶中，加10%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.5 陰性對(duì)照溶液的制備。按處方制備缺金銀花的陰性對(duì)照樣品，按“1.2.4”方法制成陰性對(duì)照溶液，即得。

1.2.6 方法學(xué)考察。

1.2.6.1 專屬性考察。分別取“1.2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、“1.2.4”項(xiàng)下供試品溶液及“1.2.5”項(xiàng)下陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按“1.2.1”色譜條件測(cè)定并記錄色譜圖。

1.2.6.2 線性關(guān)系考察。取“1.2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別精密吸取2、5、10、15、20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、綠原酸的進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.2.6.3 精密度試驗(yàn)。取“1.2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“1.2.1”色譜條件，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD。

1.2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn)。取雙葛止瀉口服液（批號(hào)20170201），按照“1.2.4”方法制備供試品溶液，分別制備6份，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量及RSD。

1.2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取雙葛止瀉口服液（批號(hào)20170201），按照“1.2.4”方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD。

1.2.6.6 加樣回收率試驗(yàn)。取已知含量的雙葛止瀉口服液樣品6份（批號(hào)20170201，綠原酸含量1.01 mg/mL），每份1 mL，置50 mL容量瓶中，各精密加入“1.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液5 mL，按照“1.2.4”方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量及加樣回收率。

1.2.7 耐用性。

為了考察色譜條件發(fā)生小的變動(dòng)時(shí)測(cè)定結(jié)果受影響的程度，分別考察流動(dòng)相比例、柱溫、流速及色譜柱型號(hào)發(fā)生變化時(shí)樣品含量的變化情況。按“1.2.3”和“1.2.4”方法分別制備對(duì)照品溶液與供試品溶液，采用單因素法，每次變動(dòng)其中一個(gè)因素，固定其他因素為中間條件，依法測(cè)定含量，并計(jì)算每個(gè)因素下含量測(cè)定結(jié)果的RSD。

1.2.8 樣品測(cè)定。

取雙葛止瀉口服液樣品（批號(hào)20170201、20170202、20170203），按“1.2.4”方法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，依法測(cè)定并計(jì)算樣品中綠原酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性考察。按“1.2.6.1”方法進(jìn)行操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1），供試品溶液在與綠原酸對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性對(duì)照在與綠原酸對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置處無色譜峰，說明該方法專屬性較好。

2.1.2 線性關(guān)系考察。按“1.2.6.2”方法進(jìn)行操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程，結(jié)果得出綠原酸的回歸方程為Y=3 128 437.351 7X-48 317.243 9（r=0.999 9），表明綠原酸進(jìn)樣量在0.082 5～0.825 0 μg峰面積與進(jìn)樣量線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn)。按“1.2.6.3”方法進(jìn)行操作，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖，測(cè)得峰面積的RSD為0.2%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.6.4”方法進(jìn)行操作，分別制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果得出6份樣品含量的RSD為0.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.6.5”方法進(jìn)行操作，分別在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣分析并計(jì)算峰面積的RSD，結(jié)果得出RSD為0.3%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn)。按“1.2.6.6”方法進(jìn)行操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），6份樣品的加樣回收率為103.28%～104.36%，平均回收率為104.0%，RSD為0.4%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 耐用性

按照“1.2.7”方法進(jìn)行操作，結(jié)果表明（表2），當(dāng)流動(dòng)相比例、柱溫、流速發(fā)生微小變化以及使用不同型號(hào)的色譜柱時(shí)，對(duì)含量測(cè)定結(jié)果無顯著影響，表明色譜條件的耐用性良好。

2.3 樣品測(cè)定

按照“1.2.8”方法操作，分別對(duì)雙葛止瀉口服液3批樣品（20170201、20170202、20170203）的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3批樣品的含量分別為0.99、0.85、0.99 mg/mL。

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過紫外掃描，綠原酸在328 nm處有最大吸收，因《中國(guó)獸藥典》2015年版一部[6]金銀花藥材含量測(cè)定項(xiàng)綠原酸檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm，且文獻(xiàn)報(bào)道中[7-9]，綠原酸的檢測(cè)波長(zhǎng)也多采用327 nm。綜合考慮，選擇327 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 色譜條件的考察

參考《中國(guó)獸藥典》2015年版一部金銀花藥材及相關(guān)文獻(xiàn)方法[10]，流動(dòng)相以乙腈- 0.4%磷酸溶液（13∶87）為基礎(chǔ)進(jìn)行比例調(diào)整，結(jié)果以乙腈- 0.4%磷酸溶液（11∶89）為流動(dòng)相梯度洗脫，所得色譜峰峰形較好，陰性對(duì)照無干擾。通過不同流動(dòng)相比例、柱溫、流速、pH、色譜柱的耐用性試驗(yàn)，表明該方法色譜條件的耐用性較好。

3.3 流動(dòng)相洗脫方式的選擇

為縮短樣品運(yùn)行時(shí)間，提高檢測(cè)效率，分別比較了等度洗脫與梯度洗脫2種條件下的色譜行為。等度洗脫的流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸水（11∶89），梯度洗脫條件同“1.2.1 ”梯度洗脫程序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在等度洗脫條件下，采用色譜柱Aglient ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），樣品中最后一個(gè)峰保留時(shí)間為46.488 min。在梯度洗脫條件下，樣品運(yùn)行時(shí)間為25 min，流動(dòng)相的比例變化發(fā)生在主峰之后，可以將主峰之后的成分盡快沖出而縮短運(yùn)行時(shí)間，且對(duì)主峰的色譜行為沒有影響。因此確定綠原酸的含量測(cè)定采用梯度洗脫。

該研究建立了一種高效液相色譜法測(cè)定雙葛止瀉口服液中綠原酸含量的方法，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性好，可用于該制劑中綠原酸的質(zhì)量控制。

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