豬化膿隱秘桿菌的分離及鑒定

劉 杰，劉守川，趙坤坤，李英英，劉維康

(洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司,河南 洛陽 471000)

2018年1月河南某豬場發生一起以關節腫脹、肺臟膿腫和胸腔積液為主要特征的疾病，臨床診斷疑似為副豬嗜血桿菌，無菌取胸腔積液和肺臟送至實驗室，進行實驗室鑒定，分離到一株革蘭氏陽性桿菌，經生化、16S rRNA鑒定并結合臨床癥狀確定為由化膿隱秘桿菌引起的細菌疾病。

1 材料與方法

1.1 組織

無菌采取發病仔豬的肺臟和胸腔積液。

1.2 主要培養基及試劑

哥倫比亞血瓊脂基礎培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養基；無支原體新生牛血清；革蘭氏染 色 試 劑；DNA Taq酶、dNTPs、DNAmarker等；細菌微量生化管及藥敏紙片。

1.3 方法

1.3.1 培養基制備

按照配方稱取足量哥倫比亞血瓊脂基礎培養基，加相應的純化水配制100 mL培養基，121 ℃，滅菌15 min，滅菌結束后待培養基溫度降至50 ℃左右，加入5 mL的綿羊血，搖勻，倒平皿。

按照配方稱取足量TSA，加相應的純化水配制100 mL培養基，121 ℃，滅菌15 min，滅菌結束后待培養基溫度降至50℃左右，加入5 mL無支原體新生牛血清和100μL 1%NAD，搖勻，倒平皿。

1.3.2 細菌分離

無菌取肺臟病變組織和胸腔積液接于血培養基和TSA+血清+NAD培養基上，37 ℃，厭氧培養48 h，觀察菌落形態，挑取單個疑似菌落進行革蘭氏染色鏡檢。

1.3.3 生化鑒定

挑取疑似單個菌落接于微量生化管，進行相應的生化鑒定。

1.3.4 16SrDNA鑒定

挑取單個菌落進行16SrDNA測序分析，引物為實驗 室 常 用 引 物 :16S-F1500：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’,16S-R1500：5’-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT，擴增出的目的片段大小約為1 500 bp，該引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

PCR采用50μL反應體系，即10×PCR Buffer5.0μL、dNTP4.0μL、DNA Taq酶1.0μL，16S-F1500/16S-R1500引物各2.0μL，DNA模板4.0μL，ddH2O 32.0μL。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 60 s，56℃ 30 s，72℃ 90 s，共30個循環；72 ℃10 min。取部分PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，剩余產物送北京英濰捷基公司測序，根據測序結果進行分析。

1.3.5 藥敏試驗

挑取疑似單個菌落接種于10 mLTSB血清培養基，置于37℃恒溫搖床中，培養5～6 h，取100μL均勻涂布于MH培養基上。用紙片瓊脂擴散法（K-B法）[1]，按使用說明書將藥敏片均勻放置在其上，37 ℃培養16～18 h后，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小，根據說明書敏感和耐藥性的最小抑菌圈直徑判定菌株的藥敏性。

2 結果

2.1 細菌分離結果

樣品經分離厭氧培養后觀察，血平板和TSA+血清+NAD培養基上為兩種菌落，優勢菌落為一種表面光滑的小菌落，該菌落在血平皿上為β溶血，革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽性小桿菌，見圖1。

2.2 生化鑒定結果

從表1不難看出，分離到的菌株發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖，不發酵甘露醇、山梨醇，硝酸鹽、接觸酶和吲哚試驗陰性，與化膿隱秘桿菌生化特性一致。

2.3 16S rDNA鑒定

圖1 革蘭氏染色鏡檢（1000×）

表1 生化鑒定結果

利用16S rDNA 檢測引物擴增出大小為1.5 kb左右的目的片段，如圖2。對測序結果用DNASTAR軟件處理，并與MCBI中已發表的16S rRNA基因序列進行同源性比較，選取同源性最高菌株的16S rRNA基因序列，采用DNASTAR-MEGALIGN軟件進行多重序列比對分析，并系統進化樹，如圖3。從表2可以看出，目的菌與Trueperella pyogenes strain ATCC 19411同源性為99.7%，證明該菌為化膿隱秘桿菌。

2.4 藥敏試驗結果

分離到的菌對頭孢噻呋、桿菌肽、卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、恩諾沙星高度敏感，對甲氧芐啶、甲砜霉素、鹽酸克林霉素和鹽酸林可霉素耐藥，如表3。

3 討論

圖2 細菌16S擴增結果

圖3 16S rRNA 基因全序列系統發育樹圖

表3 藥敏試驗結果

化膿隱秘桿菌屬于隱秘桿菌屬，是豬、牛、羊和其他動物黏膜上一種條件致病菌[2]，而且對人類的也有一定的致病性[3]，該菌為原發性病原體，能夠在家畜間廣泛傳播，導致多種化膿性感染，主要引起化膿性肺炎、關節炎而且嚴重時可導致動物因敗血癥死亡[4]。部分癥狀與副豬嗜血桿菌癥狀相似,但其主要引起肝、肺化膿性結節，脾出血性腫大，在實際診斷過程中需要通過實驗室診斷進一步確定。

化膿隱秘桿菌引起的疾病在牛羊養殖中較為常見，在養豬過程中較為少見，近年來有多篇報道在河北、湖北、湖南等省份發現由該菌引起的以發生肝、肺化膿性結節為主要特征的病例。

化膿隱秘桿菌主要包括4種毒力因子，即溶血素、膠原結合蛋白、神經氨酸酶及菌毛合成蛋白。化膿隱秘桿菌的致病力主要是通過這4種毒力因子體現，通過對這4種毒力因子的研究發現化膿隱秘桿菌的主要致病機理是通過神經氨酸酶提高病原菌的黏附力及致病力，并降解抗體，降低宿主免疫防御力從而使宿主發病，另外溶血素能夠溶解紅細胞及免疫細胞，也能夠影響宿主的免疫力。在實際臨床診斷中通過對這4種毒力基因的研究可對其進化過程進行大致推斷[5-7]。

本次藥敏試驗敏感藥主要有頭孢噻呋、桿菌肽、卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、恩諾沙星高度敏感。鑒于此次化膿隱秘桿菌主要引起的臨床癥狀主要為關節炎和肺臟化膿性結節，推薦使用穿透力較強的頭孢噻呋和恩諾沙星，治療效果較為明顯。