復(fù)合緩釋酸制劑對豬流行性腹瀉病毒的體外作用研究

趙勤輝

（意大利亞士可化工大藥廠，上海 200233）

1 豬流行性腹瀉流行病學(xué)與概況

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea, PED）是一種由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的，以嚴重的腸炎、腹瀉、嘔吐、脫水和仔豬高死亡率為顯著特征的豬急性高度接觸性腸道傳染病，PEDV主要侵害哺乳仔豬，7日齡以內(nèi)的仔豬死亡率可高達100%。

該病于1971年首次在英國被發(fā)現(xiàn)，1978年比利時Pensaert MB教授分離出病原，命名為CV777毒株，我國1978年從上海分離到滬毒株。2010年在我國大面積暴發(fā)PED，造成了數(shù)以千萬計哺乳仔豬的死亡，2013年又重創(chuàng)了美國養(yǎng)豬業(yè)，超過17個州的養(yǎng)殖場感染了PEDV，造成大量仔豬的死亡。

2 PEDV基因組結(jié)構(gòu)

PEDV為單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科，只有一個血清型，對外界環(huán)境有較強的抵抗力。PEDV基因組至少有7個開放閱讀框，基因組長度30 000 kb左右，編碼纖突蛋白（spike protein, S），小包膜蛋白(envelope, E)，糖膜蛋白（membrane, M）和核衣殼蛋白（nucleocapsid， N）等4種主要結(jié)構(gòu)蛋白和3種非結(jié)構(gòu)蛋白（復(fù)制酶蛋白1a和1b、ORF3蛋白），其中S蛋白位于病毒粒子外表面，在病毒侵入宿主細胞和誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過程中發(fā)揮重要作用[1]，利用其表面的S蛋白與豬腸道細胞表面受體結(jié)合，通過膜融合侵入細胞內(nèi)，集中在豬小腸絨毛上皮細胞中復(fù)制，新生病毒通過糞便和嘔吐物排出體外。PEDV的主要中和抗原位于S基因的1 495-1 914 bp處[2]。

3 PEDV的傳播方式與特點

PEDV在37℃條件下最適合的pH是6.5～7.5。據(jù)美國明尼蘇達大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院Dee等研究報道，PEDV在豆粕粉中可以存活180 d[3]。PEDV可以通過飼料傳播并造成母豬和生長豬發(fā)病[4]。PED主要靠糞口傳播，與發(fā)病豬、帶毒豬直接接觸或者接觸被污染的食物、水、車、人以及環(huán)境、灰塵、氣溶膠也能傳播PEDV。PEDV具有組織嗜性的特點，主要侵害腸絨毛上皮細胞，引起變性、萎縮、脫落。

4 PED的防控難點

1)新變異株不斷出現(xiàn)，不同毒株之間的交叉保護率低。

2)病毒分離困難，有經(jīng)驗的實驗室分離成功率都只能做到20%～30%。

3)疫苗免疫效果評估困難。目前單純的實驗室評價血清或者初乳中SIgA并不能與發(fā)病率建立起很好的掛鉤。在實際生產(chǎn)中經(jīng)常看到，有些豬場沒打疫苗也不發(fā)生PED，也有許多豬場打了疫苗還發(fā)生PED；有的豬場去年打了疫苗但發(fā)病死亡率高，第二年不打疫苗發(fā)病死亡率卻不高。老板、管理者、獸醫(yī)莫衷一是。

4)疫苗免疫效果尚待商榷。PEDV主要以腸道局部免疫為主，傳統(tǒng)的活苗抗原滴度有限，致弱后的疫苗毒株在腸道的穩(wěn)定性和增殖能力降低，難于侵入腸道，產(chǎn)生的保護力有限；滅活苗不能產(chǎn)生有效的黏膜免疫，保護率偏低。

5)混合感染居多（PEDV與TGEV、PoRV、PRRSV、PCV2、PRV），增加了防控難度。

6)返飼是傳統(tǒng)的防控PED的方法，但是存在2個問題，一是返飼前要做特定病原體的檢測，存在一定的難于預(yù)見的散毒風(fēng)險；二是返飼始終是屬于被動的防控，即出了問題之后才去返飼，屬于亡羊補牢型防控。

7)當(dāng)然行業(yè)內(nèi)也摸索出了一定的防控PED的方式方法，如多點式飼養(yǎng)，后備豬進群前PEDV活毒馴化，通過實驗室監(jiān)測后備豬過了排毒期才能進種群，活苗與死苗相結(jié)合的接種方法，私制自家苗等，但是總體效果還是不盡如人意。

所以，PED的防控目前還是行業(yè)內(nèi)的難題之一。決定PED發(fā)病與否的主要是以下幾個因素：毒量、毒力、腸道菌群與SIgA。所以，降低豬群中的病毒載量，提升豬群腸道健康度以及初乳管理是防控PED的經(jīng)典法則。

5 酸制劑降低PEDV載量的相關(guān)研究

美國明尼蘇達大學(xué)的Trudeau等人研究表明，有機酸不僅在防控腸道致病細菌上有效果，對PEDV等病毒也具有很好的抑制作用，不同商品化酸制劑添加在飼料中對PEDV具有不同的抑制作用（表1）[5]。

6 復(fù)合緩釋酸對PEDV的體外影響研究

6.1 實驗材料

Vero細胞，復(fù)合緩釋酸，AH2012病毒液，反轉(zhuǎn)錄酶，ddH20，探針定量試劑，PEDV抗原檢測試劑盒，DMEM，24孔板，96孔板，胰酶，PBS，恒溫箱等。

6.2 實驗步驟略

6.2.1 實驗一：復(fù)合緩釋酸對PEDV核酸的作用

1）復(fù)合緩釋酸對PEDV核酸的作用（37 ℃作用30 min）

結(jié)果：從組內(nèi)趨勢看，作用30 min后，隨著復(fù)合緩釋酸的稀釋，病毒含量逐漸增高，1:1 000稀釋后的復(fù)合緩釋酸對病毒核酸作用不明顯，病毒含量明顯高于其他4組，等體積1:1混合組的PEDV含量最低，表明高濃度復(fù)合緩釋酸可以破壞病毒的核酸，從圖1可看到1:1～1:100稀釋復(fù)合緩釋酸都能夠顯著的破壞病毒核酸。

2）復(fù)合緩釋酸對PEDV核酸的作用（37℃作用2 h）

37℃條件下，復(fù)合緩釋酸病毒與復(fù)合緩釋酸1:1混合和復(fù)合緩釋酸稀釋1:10的梯度都對病毒的核酸有明顯破壞作用，陰陽性成立，結(jié)果成立，表明37℃作用2 h對病毒都有破壞作用。

從圖2可看出，陰陽性成立，復(fù)合緩釋酸和病毒1:1混合作用后，有明顯的破壞病毒核酸的作用。

6.2.2 實驗二：復(fù)合緩釋酸對病毒蛋白的作用（37℃，室溫作用2 h）

圖1 復(fù)合緩釋酸對PEDV核酸的作用（37 ℃作用30 min）

圖2 復(fù)合緩釋酸對PEDV核酸的作用（37 ℃作用2 h）

表1 不同商品化酸制劑對飼料中PEDV的抑制作用

表2 試驗結(jié)果

表3 未過濾與過濾復(fù)合緩釋酸不同稀釋比例的細胞毒性作用

圖3 復(fù)合緩釋酸對病毒蛋白的作用（37 ℃，室溫作用2 h）

結(jié)果：37 ℃作用2 h后，病毒本身蛋白有所降解，濃度降低，與復(fù)合緩釋酸混合后，同樣發(fā)現(xiàn)1:1和1:10混合對病毒蛋白有明顯的破壞作用（見圖3）。表明，一定濃度的復(fù)合緩釋酸作用一定時間對PEDV病毒蛋白具有破壞作用。

6.2.3 實驗三：復(fù)合緩釋酸細胞毒性實驗

結(jié)果：從表3的實驗結(jié)果可以看出，未過濾的復(fù)合緩釋酸稀釋度為1:4導(dǎo)致細胞發(fā)生病變，對細胞有毒性作用；過濾后的復(fù)合緩釋酸稀釋度在1:2對細胞有毒性，推測過濾后的復(fù)合緩釋酸可能有損失。表明，小于等于1:8的稀釋比例對Vero細胞都不會產(chǎn)生毒性細胞病變。

6.2.4 實驗四：復(fù)合緩釋酸對PEDV致病性作用（TCID50）

結(jié)果：1)可看到復(fù)合緩釋酸原液與病毒等比例稀釋，不論作用多久，病毒完全不產(chǎn)生病變，對病毒致病性有完全殺滅作用；

2)復(fù)合緩釋酸稀釋 1：2，1：4，1：8且在作用15 min，30 min對病毒有輕微的滅毒作用，作用1 h 則可起到大部分殺滅作用（見表4），說明作用時間長短對殺滅總用是有影響的，但總體來說，復(fù)合緩釋酸對病毒有較好的殺滅作用。

實驗表明，一定濃度的復(fù)合緩釋酸作用PEDV一段時間后，會使PEDV失去感染細胞和產(chǎn)生細胞病變的能力。

圖4 復(fù)合緩釋酸對PEDV復(fù)制的影響

表4 復(fù)合緩釋酸不同稀釋比例對病毒產(chǎn)生細胞病變能力的影響

6.2.5 實驗5：復(fù)合緩釋酸對PEDV復(fù)制的影響（病毒拷貝數(shù)）

結(jié)果：現(xiàn)象觀察發(fā)現(xiàn)1：4組無病變，1：8有輕微病變，1：16局部出現(xiàn)病變，1：32，1:64，128和病毒對照都全部病變，沒有太大差異（見圖4）。病毒拷貝數(shù)定量結(jié)果顯示，復(fù)合緩釋酸1:16稀釋后仍然能夠顯著抑制病毒的復(fù)制，具有較好的抗病毒效果。

實驗5表明，一定濃度的復(fù)合緩釋酸作用PEDV一段時間后，可以抑制病毒的復(fù)制。

綜上所有實驗得出結(jié)論，一定濃度復(fù)合緩釋酸對病毒的核酸、蛋白都有破壞作用，可以直接殺滅病毒。同時，一定濃度復(fù)合緩釋酸可以抑制病毒的細胞中的增殖，影響病毒的復(fù)制。