3，6'-二芥子酰基蔗糖對卒中后抑郁星型膠質細胞的影響

鄒文靜 賈濛濛 葉夢瑤 茅瑛琦 裘濤 陶水良*

卒中后抑郁是腦卒中后較常見的一種并發癥，流行病學資料顯示其發病率占腦卒中患者的33%～50%，臨床主要表現為情緒低落、精神萎靡、焦慮、絕望等情感變化，甚至有自殺傾向［1］。目前卒中后抑郁治療以SSRI類等抗抑郁藥物為主，但其存在有效率低，起效慢，復發率高，不同程度的毒副作用，導致自殺傾向等一系列缺點。中醫在卒中后抑郁的治療上存在一定的優勢［2］。研究表明慢性不可預知性應激下減少大鼠海馬星型膠質細胞的數量和體積，同時降低GFAP的水平［3］。2016年7月至2018年1月作者通過動物實驗，研究3，6'-二芥子酰基蔗糖對卒中后抑郁大鼠行為學改變和星型膠質細胞（AS）功能的影響，初步了解3，6'-二芥子酰基蔗糖對卒中后抑郁的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 成年健康雄性SD大鼠40只，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，批號：SCXK（滬）.2012-0002。實驗于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心進行，以5只一籠群養的標準安放大鼠，1次/d更換墊料，保持籠內環境清潔，保持晝夜更替，給予正常飲食，飼養2周，抓取1次/2d，使其適應動物房環境以及實驗操作人員。

1.2 藥物及試劑 遠志提取物（3，6'-二芥子酰基蔗糖）：純度99.06%（HPLC）（成都曼斯特生物科技有限公司研制，批號：MUST-16070608）。鹽酸氟西汀分散片，規格為20mg，28片/盒，批號：160622，廠家：PATHEON FRANCE。KN93（CaMKⅡ抑制劑）5mg（美國MCE公司生產），ab7260Anti-GFAP（杭州寶科生物科技有限公司提供 兔抗大鼠，批號GR3187698），超敏酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物（PV-8000）（北京中杉金橋生物技術有限公司生產，批號107257D9），Anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor（R）488 Probes（杭州柏奧谷科技有限公司提供 批號 17）。

1.3 方法 （1）卒中后抑郁模型的建立：在改良Zea-Longa線栓法基礎上通過大腦中動脈栓塞法建立大鼠腦卒中模型［4］，根據Longa［5］神經功能損傷評分可確定大鼠腦卒中后模型制備成功，1周后，在此基礎利用孤養聯合束縛應激處理造成患病后大鼠的壓抑環境2～3周制備PSD模型。（2）分組與給藥：在予大鼠中動脈閉塞（MCAO）模型前隨機抽取10只正常大鼠成組，5只/籠飼養，不予給藥，予正常飲食生活。30只PSD模型大鼠隨機被分為： PSD+NS組、PSD+Flx組、PSD+YZ組，每組各10只。各組每籠1只飼養。給藥周期為21d，從束縛第1天開始，每日于束縛前30min，PSD+YZ組予遠志提取物，給藥量為4.7g/（kg·d）（按人體用藥量換算成大鼠等效劑量），PSD+Flx組予氟西汀藥液灌服1次，用量為1.8mg/（kg·d），正常組和PSD+NS組則灌服等量的生理鹽水［每只6.7ml/（kg·d）］。（3）糖水偏好程度檢測：各組大鼠于孤養束縛后第7、14、21天進行糖水偏好試驗。大鼠禁食禁水21h后開始實驗，一瓶1%糖水和一瓶純凈水分別放置在每個測試鼠籠前，1h后互換兩個水瓶位置，再過1h后取瓶，測量并計算動物的糖水偏好程度。糖水偏好程度=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。（4）取材：治療第21天后，端頭處死全部大鼠，每組有3只取全腦，用錫紙包裹，投至液氮中，隨后移至-80℃超低溫冰箱中保存待用。（5）免疫組織化學染色：選取冰凍腦組織頂葉切割，對各組冰凍切片進行免疫組織化學二部法染色，一抗為ab7260Anti-GFAP antibody，每個腦片中加入一抗37℃溫箱孵育60min，漂洗后加入種屬匹配的二抗試劑，37℃溫箱孵育60min，漂洗后DAB顯色1～2min，二甲苯透明，中性樹膠封固。每組3只大鼠，每只大鼠隨機選取3張切片，每張切片用Nikon eclipse 80i顯微鏡拍攝照片。每張切片隨機選擇400×下的3個視野，應用Carl Zeiss Imaging Systems圖像分析軟件系統對GFAP平均光密度值（MOD）進行圖像分析處理。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件。符合正態分布計量資料以（±s）表示，用方差分析；非正態分布用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠糖水偏好程度 束縛第7天，PSD+NS組、PSD+FLX組大鼠糖水偏好程度較正常組明顯降低（P＜0.05），PSD+YZ組大鼠糖水偏好程度較正常組顯著升高（P＜0.05）。束縛3周后，PSD+FLX組大鼠糖水偏好程度改善；PSD+NS組大鼠糖水偏好程度呈持續下降趨勢，PSD+YZ組大鼠糖水偏好持續在較高的狀態。各組大鼠建模后3個時間點重復測量方差分析顯示：球形度P=0.169，時間效應F=2.957，P=0.06；組間效應F=109.795，P＜0.001；時間組別交互效應F=3.363，P=0.01。組間差異有統計學意義，時間和組間存在交互效應。見表1。

表1 各組大鼠糖水偏好程度結果比較（±s）

表1 各組大鼠糖水偏好程度結果比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，與PSD+NS組比較，#P＜0.05

組別 束縛第7天 束縛第14天 束縛第21天PSD+FLX組 0.71±0.04* 0.71±0.05 0.72±0.02*#PSD+YZ組 0.97±0.03*# 0.96±0.03*# 0.97±0.01*#PSD+NS組 0.72±0.02* 0.69±0.07 0.58±0.07*正常組 0.85±0.07# 0.78±0.09 0.83±0.03#

2.2 各組大鼠頂葉GFAP的MOD分析比較 PSD+NS組GFAP的MOD較正常組、PSD+FLX組、PSD+YZ組 明 顯 降 低（P＜0.05），PSD+YZ組 與 PSD+FLX組GFAP的MOD相當（P＞0.05）。正常組GFAP的MOD較PSD+YZ組及PSD+FLX稍低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。

表2 各組大鼠頂葉GFAP（MOD）分析（±s）

表2 各組大鼠頂葉GFAP（MOD）分析（±s）

注：與PSD+NS組比較，*P＜0.05

組別 GFAP（MOD）PSD+FLX組 0.116±0.003*PSD+YZ組 0.116±0.007*PSD+NS組 0.107±0.005正常組 0.114±0.004*

3 討論

星型膠質細胞（AS）是中樞神經系統分布最廣，用途最多的膠質細胞。星型膠質細胞能分泌多種神經營養因子，對神經元起營養支持作用，促進神經元生長、修復、再生［6］；參與突觸結構的形成，影響突觸的凋亡［7-8］；參與神經細胞的功能調節，影響神經元的興奮性傳遞［9］。膠質纖維酸性蛋白（GFAP）是星型膠質細胞活化的標志物，其表達的強弱反映星型膠質細胞的活躍狀態，主要參與星型膠質細胞-神經元之間的信息傳遞［10］。大量研究表明抑郁癥大鼠模型細胞內星型膠質細胞數量顯著減少，GFAP表達也相應減少［11-13］。氟西汀的治療可以增加抑郁癥患者星型膠質細胞的數量，調節星型膠質細胞中特異性蛋白的表達，增加其突觸分支的可塑性，從而改善星型膠質細胞的形態功能，發揮抗抑郁作用［14-15］。

《神農本草經》記載遠志味苦、性溫，歸心、腎、肺經，具有養心安神定志，祛痰鎮咳消腫等功能。研究表明遠志有抗抑郁，抗癲癇，抗癡呆，鎮咳祛痰，保護心腦血管等作用［16-18］。其化學成分主要有三萜皂苷類、寡糖酯、哐山酮類等化合物，3，6'-二芥子酰基蔗糖是寡糖酯類單體化合物。HU等［19］研究表明3，6'-二芥子酰基蔗糖有抗抑郁作用，其作用機制與下丘腦-垂體-腎上腺皮質激素軸及生物氧化系統有關。章主恒等［20］發現遠志中有效成分可通過調節單胺類神經遞質再攝取過程發揮抗抑郁作用。

本資料結果顯示，束縛3周后，與正常組比較，PSD+NS組糖水偏好程度明顯下降（P＜0.05），PSD+FLX組較PSD+NS組糖水偏好程度上升，PSD+YZ組糖水偏好程度程度明顯上升（P＜0.05）。由此發現PSD模型是可以通過建立MCAO模型后利用孤養結合束縛被成功復制。與正常組比較，PSD+NS組GFAP的MOD顯著減少（P＜0.05）；與PSD+NS組比較，PSD+FLX組及PSD+YZ組GFAP的MOD增多，差異有統計學意義（P＜0.05）；PSD+YZ組與PSD+FLX組比較，PSD+YZ組糖水偏好程度程度明顯上升（P＜0.05），GFAP的MOD相當（P＞0.05）。免疫組化結果顯示正常組星型膠質細胞的GFAP表達多，胞體小，突起豐富，纖維排列呈放射狀；PSD+NS組星型膠質細胞的GFAP表達明顯減少，胞體腫脹，突起減少，纖維排列稀疏；PSD+FLX組及PSD+YZ組表達增多，胞體稍大，突起延長，分支增多，纖維排列不規則。故遠志提取物3，6'-二芥子酰基蔗糖可以改善大鼠行為學（糖水偏好程度），增加星型膠質細胞中GFAP的平均光密度值，改善星型膠質細胞形態。綜上，3，6'-二芥子酰基蔗糖可能通過同時增加GFAP的表達，改善星型膠質細胞功能，起到抗抑郁的作用。