芪山無糖顆粒對糖尿病前期大鼠SOCS-3及JAK2 STAT1的影響

侯鵬超 葉迅 魏燕 洪郁芝*

近年來糖尿病在我國的形式日益嚴峻，如何早發現早診斷早治療成為糖尿病現在研究的熱點。目前認為糖尿病前期的糖代謝異常具有高度的可逆性，即給予該階段及時、合理、科學的干預措施，糖尿病前期可以逆轉為糖耐量正常。國外已有羅格列酮干預糖尿病前期的實驗研究，但其存在心血管副作用、患者依從性差等狀況，較難適應目前我國國情。芪山無糖顆粒是本院對糖尿病前期經典方進行有效成分提取、生產工藝優選后制成的復方飲片顆粒劑。2013年3月至2014年9月作者通過大鼠動物實驗，進一步探討芪山無糖顆粒劑干預糖尿病前期的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 4周齡雄性SPF級SD大鼠60只，體重（100±20）g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供［SCXK(滬)2013-0016］。飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心［SCXK(浙)2008-0115］。溫度（20±2）℃，相對濕度50%～70%，12h/12h交替照明。芪山無糖顆粒配置自杭州市中醫院制劑中心，由黃芪、山藥、茯苓、黃連、絞股藍、炒枳殼、生山楂、川芎、葛根、蒼術配置而成，經濃煎后提取上清液制作成顆粒劑，批號：130405；馬來酸羅格列酮購自英國GlaxoSmithKline公司；SOCS-3引物購買自生工生物工程(上海)股份有限公司；JAK2抗體購自美國Proteintech公司，STAT1抗體購自英國Abcam公司。

1.2 方法 （1）分組和建模：SD雄性大鼠通過長期的高糖高脂喂食制造糖尿病前期模型。取出生4周SD雄性大鼠60只，體重（100±20）g，普通飼料喂食2周適應環境后，隨機分成6組：正常對照組（NC）、高脂對照組（MC）、 低劑量中藥組（Z1）、中劑量中藥組（Z2）、高劑量中藥組（Z3）、羅格列酮組（X）。每組10只，其中8只為實驗用鼠，其余2只為備用。NC組采用大鼠普通飼料喂食，MC、Z1、Z2、Z3、X組采用大鼠高脂飼料喂食；16周后 MC、Z1、Z2、Z3、X比NC的體重和2hPG同時出現顯著增高（P＜0.01），糖尿病前期造模成功。（2）藥物干預：造模成功后，各組繼續原飼料喂養同時，并予以藥物灌胃治療16周。NC、MC組采用蒸餾水2ml/d灌胃，Z1、Z2、Z3組分別使用中藥 1.5625g/（kg·d）（等同于人的用量）、3.125g/（kg·d）（等同于人用量的 2 倍）、6.25g/（kg·d）（等同于人用量的4倍)灌胃，X組采用羅格列酮0.833mg/（kg·d）（相當于人的最大推薦劑量）灌胃。用藥16周后，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠后處死。（3）RT-PCR檢測大鼠肝臟SOCS-3基因表達。取大鼠肝臟組織用TRIzol提取RNA，并檢測RNA濃度。將相同濃度的RNA逆轉為cDNA，按照預設引物(見表1)實行PCR擴增。β-action：94℃ 30s，57.5℃ 30s，72℃ 30s；共27個循環。SOCS-3：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s；共34個循環。最后進行瓊脂糖電泳和分析。整個過程重復3次，最終確定SOCS-3的基因表達量。（4）Western Blot檢測大鼠胰腺JAK2、STAT1蛋白表達：取大鼠胰腺組織用RIPA裂解液提取蛋白，并檢測蛋白濃度。將相同濃度的蛋白進行蛋白電泳，并完成轉膜。相應加入JAK2、STAT1一抗和熒光二抗進行孵育。最后在雙色熒光成像系統上進行分析。整個過程重復3次，最終確定JAK2和STAT1的蛋白表達量。

表 1 PCR引物

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較使用方差分析，組間兩兩比較，方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Tamhane’s T2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組體重和2hPG比較 見表2。

表 2 各組體重和2hPG比較（±s）

表 2 各組體重和2hPG比較（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.01

組別 n 基礎體重（g） 16周體重（g） 基礎2hPG（mmol/L）16周2hPG（mmol/L）NC 8 218.35±8.95 454.09±39.94 6.81±0.50 6.74±0.23 MC 8 217.46±19.54 543.96±69.05* 6.18±0.60 8.80±0.86*Z1 8 217.56±13.17 537.41±64.53* 6.68±0.80 9.21±0.85*Z2 8 224.11±9.91 539.00±40.06* 6.65±0.60 8.71±0.74*Z3 8 215.08±12.38 527.54±48.09* 6.58±0.89 8.68±0.78*X 8 218.81±13.47 529.99±53.12* 6.91±1.03 9.01±0.65*

2.2 各組SOCS-3基因表達比較 見表3。

表 3 各組SOCS-3基因表達（±s）

表 3 各組SOCS-3基因表達（±s）

注：與NC組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與MC組比較，▲P＜0.05；與Z兩組比較★P＜0.05

SOCS-3 NC 8 0.4698±0.1694 MC 8 1.6731±0.1796△△Z1 8 1.4945±0.3093△△Z2 8 1.0324±0.1933△△▲Z3 8 0.7363±0.099△▲★X 8 0.7275±0.1052△▲★n

2.3 各組JAK2、STAT1表達比較 見表4。

表4 各組JAK2、STAT1表達比較（±s）

表4 各組JAK2、STAT1表達比較（±s）

注：與NC組比較，△P＜0.05；與MC組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與Z1組比較■P＜0.05，■■P＜0.01；與Z兩組比較★P＜0.05，★★P＜0.01；與Z3比較，#P＜0.05

8 1.334±0.2075▲▲■■★# 1.2755±0.0714△▲▲■■★★JAK2 STAT1 NC 8 1.408±0.2983 1.6946±0.1325 MC 8 0.4874±0.1639△ 0.4073±0.2172△Z1 8 0.7469±0.2043△▲ 0.857±0.1842△▲▲Z2 8 0.953±0.1364△▲▲■ 1.0368±0.1836△▲▲■Z3 8 1.0788±0.0897△▲▲■■ 0.7217±0.1826△▲▲★★X n

3 討論

2型糖尿病大鼠動物模型建立已有較為成熟建模方法，一般采用小劑量左旋鏈脲菌素(STZ)20～30mg/kg腹腔注射破壞大鼠胰腺達到大鼠血糖升高，同時配合高脂飲食造成大鼠肥胖，兩者結合達到造模要求［1］。但目前缺乏糖尿病前期模型建立的相關文獻，而采用STZ建立糖尿病前期模型較難得到滿意的效果，STZ的胰腺破壞效果不穩定，且與注射前大鼠空腹時間有密切的關系，空腹時間越長胰腺破壞程度越嚴重，常造成20～30mmol/L高血糖，無法符合糖尿病前期的造模要求；Ionut V認為采用STZ建立的動物模型，是通過急性破壞胰腺，使胰腺功能急劇下降的情況下建立的，此時動物無肥胖和胰島素抵抗，這使建立的模型更像是1型糖尿病而非其他［2］。因此確立糖尿病前期新的造模標準是實驗成功的保證。Soares E對成年Wistar大鼠采用高糖飲食，9周后與普通飲食大鼠比較，高糖Wistar大鼠表現出體重及血糖升高并伴有高胰島素血癥，以此認為糖尿病前期模型建立成功［3］。本實驗采用同樣的思路，使用較Wistar大鼠血糖表現更為穩定的SD大鼠，并通過更長時間(16周)的高糖高脂喂食，促使其體重和餐后2h血糖的同時升高（P＜0.01），以此確立糖尿病前期造模成功的標準。

本資料結果顯示，SOCS-3的基因表達隨著中藥濃度的增加出現顯著下降（P＜0.01），其中以Z3組下降最為明顯，且與羅格列酮組的效果相當（P＞0.05）。表明芪山無糖顆粒隨著藥物濃度的增加能顯著降低SOCS-3的基因表達，且與羅格列酮效果相似。JAK2蛋白的表達則隨著中藥濃度的增加出現不同程度的回升（P＜0.05或 0.01），其中 Z2、Z3組表現相當（P＞0.05），但劣勢與羅格列酮組差異有統計學意義（P＜0.05）。而在STAT1蛋白表達上，中藥中Z兩組的表達最為明顯（P＜0.05），但仍劣于羅格列酮組的表現（P＜0.01）。表明芪山無糖顆粒能升高JAK2和STAT1蛋白的表達，但受到藥物濃度的影響并不明顯，且與羅格列酮存在差距。

JAK/STAT信號通路在糖尿病前期中有重要作用。目前認為JAK/STAT信號通路是參與瘦素傳導的主要通路，瘦素能促使JAK2絡氨酸激酶的活化，從而促使STAT3、STAT5的激活，并最終導致增加胰島素的敏感性、降低血糖、抑制食欲、減輕體重［4］。有研究顯示在基因敲除的STAT3、STAT5小鼠中出現了明顯的攝食過量、肥胖、不孕等［5］。而糖尿病前期時，瘦素出現抵抗使其喪失對血糖的調節作用，進而加速了1型和2型糖尿病的發生［6］。因此在藥物對糖尿病前期的干預過程中，JAK2、STAT3、STAT5指標的表達恢復可以認為治療有效的標志。本資料中，芪山無糖顆粒干預后JAK2蛋白出現了明顯回升（P＜0.05或0.01），雖然和羅格列酮的治療效果尚存在一定的差距（P＜0.05），但已經可以證明芪山無糖顆粒可以逆轉JAK2蛋白的表達，有效干預糖尿病前期的進展。同時STAT1指標也出現了恢復（P＜0.01），同樣證明芪山無糖顆粒對STAT家族的恢復作用。

SOCS家族是JAK/STAT信號通路的上游抑制因子，其一些成員參與胰島素受體信號轉導［7］。目前認為胰島素、瘦素、生長激素等可誘導SOCS-3的基因表達，而其表達產物又可阻止這些細胞因子信號的傳導［8］。Peralta S研究證明，在胰島素抵抗及瘦素抵抗的Sprauge-Dawley大鼠下丘腦中，SOCS-3的基因表達水平增加，而實施飲食控制后，SOCS-3基因表達得到控制，提示SOCS-3參與胰島素抵抗及瘦素抵抗［9］。因此在糖尿病前期中，SOCS-3可能出現表達增加，從而抑制JAK/STAT信號通路限制JAK2、STAT的表達。因此使用藥物對糖尿病前期進行干預，SOCS-3表達減少認為治療有效。本資料中，芪山無糖顆粒干預后SOCS-3基因表達迅速出現回落（P＜0.05或＜0.01），其在大劑量藥物干預的過程中表現出和羅格列酮相同的效果，表明芪山無糖顆粒可以降低SOCS-3基因表達，改善糖尿病前期。

綜上所述，芪山無糖顆粒能逆轉糖尿病前期大鼠SOCS-3基因及JAK2、STAT1蛋白表達，證實其在早期延緩糖尿病的發生發展有著重要作用，為進一步探討芪山無糖顆粒劑干預糖尿病前期的作用機制提供理論依據，為探索適合我國國情糖尿病前期的干預方法提供中藥學依據。但其對SOCS以及STAT其他家族成員是否具有同樣作用尚需要進一步研究證實。