比沙可啶對家兔近端結腸體外運動模式的影響

黃敏，朱慶曦，田霞，韓崢，譚潔

（武漢市第三醫(yī)院 消化內科，湖北 武漢 430060）

家兔近端結腸特有的結腸袋與人結腸相似，家兔微觀層面結腸運動與功能的關系報道較多，家兔結腸運動模式具有肌源性和神經源性特征[1-2]。人結腸高振幅壓力波（high amplitude propagating pressure wave,HAPW）與家兔結腸中長距離收縮運動（long distance contraction,LDCs）相似[3]。本課題組前期對家兔結腸運動模式有一定認識[4]，深入研究結腸袋在人和家兔結腸運動模式中的作用有利于診療結腸功能紊亂。本實驗擬研究比沙可啶對家兔近端結腸運動模式影響的神經源性機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性家兔34 只，體重1.83 kg，購于武漢大學實驗動物中心，在武漢大學人民醫(yī)院實驗動物中心統(tǒng)一常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑

比沙可啶粉劑（美國Selleck 公司），河豚毒素（Tetrodotoxin,TTX）（上海寶曼生物科技有限公司），配置生理鹽水、PBS 及Krebs 緩沖液所用試劑購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計 基礎組、PBS 組（每組6 只）：以生理鹽水或PBS 迅速充盈家兔近端結腸，待運動模式穩(wěn)定約30 min 后，以1 ml/min 的速度持續(xù)腔內灌注生理鹽水或PBS，預實驗發(fā)現該速度不影響遠端量筒中的液平面。比沙可啶組（每組6 只）：用不同濃度比沙可啶混懸液（0.05、0.15 和0.25 mg/ml）以同樣速度（1 ml/min）持續(xù)灌注家兔近端結腸（給藥間隔＞ 30 min），且不斷用玻璃棒輕輕攪拌，以防比沙可啶沉淀。TTX 組（4 只）：PBS 持續(xù)腔內灌注家兔近端結腸后，在浴槽內加入2×105mol/L TTX 模擬結腸神經受損，再持續(xù)灌注不同濃度比沙可啶混懸液，觀察運動模式變化。

1.3.2 恒溫浴槽試驗 所有家兔禁食12～15 h 后，經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1 ml/kg）麻醉，分離出具有3 條結腸帶部分的近端結腸后，注入少量空氣將其處死。盡量去除結腸表面的黏膜和血管，以防影響時空圖制作。兩端分別連接液體灌注管和流出管，置于含37℃固定通氣（95%氧氣O2和5%二氧化碳CO2）Krebs 液的恒溫浴槽中（pH 7.3～7.4）。將帶有輸液泵的近端液體灌注管（內徑3 mm，外徑4 mm）連接到50 ml 注射器上，置于浴槽上方10 cm，容器內充滿PBS 溶液；遠端流出管（內徑5 mm，外徑6 mm）插入含PBS 溶液的量筒中，且將量筒置于1 000 ml 燒瓶中，腸腔內壓力大小與PBS 液面水平相關，其液面距浴槽底部約4 cm。

1.3.3 時空圖 攝像頭在浴槽正上方的以錄像方式記錄整個結腸運動，數據采集通過Microsoft Lifecam Software 軟件，影像記錄經改良Image J 軟件分析成時空圖。具有不同灰度圖像的時空圖Y 軸代表結腸直徑的變化，X 軸代表記錄的時間[5]。圖像越白代表結腸舒張越完全，內徑越大；顏色越黑代表結腸收縮程度越劇烈，內徑越小。時空圖中LDCs 表現為倒三角形黑色波，縱軸代表結腸收縮的節(jié)段，橫軸代表結腸收縮的持續(xù)時間，長度單位以浴槽底部的刻度（每小格代表1cm）進行校準，量化結腸直徑的變化。結腸運動模式的參數包括頻率（次/min，以每10 min 計算）、傳播長度（%，即傳播距離占整段近端結腸長度的百分比，由Image J 軟件中的Analyze 測量）、持續(xù)時間（s，由Image J 軟件中的Analyze 測量）、傳播速度（cm/s）及振幅指數（由Image J 軟件中的Dynamic Profile 插件讀出）等。

1.4 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件及時空圖相關軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗；計數資料以構成比（%）表示，比較用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基礎狀態(tài)下運動模式

基礎狀態(tài)下運動模式主要有：①高度節(jié)律性的袋狀收縮頻率為（0.58±0.08）次/min，推進速度（0.015±0.003）cm/s；②快速收縮頻率為（5.0±1.26）次/min；③微小波頻率較恒定，為（8.3± 1.4）次/min，可單向傳播，也可雙向傳播，通常伴隨快速收縮或袋狀收縮；④LDCs 頻率為（0.6± 0.3）次/min，振幅指數為（0.86±0.14）。

2.2 比沙可啶結腸腔內灌注引發(fā)節(jié)律性LDCs

在基礎或PBS 液持續(xù)灌注狀態(tài)下，每組僅1 只兔發(fā)生LDCs，而0.05、0.15 和0.25 mg/ml 比沙可啶組LDCs 發(fā)生率分別為44%（4/9）、67%（6/9）和89%（8/9），經χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=17.100，P=0.001），比沙可啶組高于基礎組和PBS 組，持續(xù)腔內灌注比沙可啶可引發(fā)LDCs?；A組和PBS 組LDCs頻率分別為0.5 和0.3 次/min，持續(xù)灌注0.05、0.15和0.25 mg/ml比沙可啶（31.67±6.23）min 后，各組LDCs 頻率比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=11.312，P=0.000），比沙可啶組高于基礎組和PBS組，比沙可啶組節(jié)律性LDCs 增加。見圖1和表1。

圖1 家兔近端結腸腔內灌注比沙可啶引發(fā)LDCs

不同濃度比沙可啶組的LDCs頻率比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），0.15 和0.25 mg/ml 比沙可啶組引發(fā)LDCs 頻率高于0.05 mg/ml 比沙可啶組。不同濃度比沙可啶組的LDCs 持續(xù)時間、推進速度及振幅指數比較，經方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 比沙可啶對近端結腸袋狀收縮和快速收縮運動的影響

基礎組、PBS 組、比沙可啶組的袋狀收縮和快速收縮發(fā)生率比較，經χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），比沙可啶組低于基礎組和PBS 組。當LDCs 規(guī)律出現時，袋狀收縮和快速收縮運動減弱或消失，提示比沙可啶通過引發(fā)LDCs 促進家兔近端結腸的傳輸。見表2、3。

2.4 比沙可啶增強LDCs 的神經源性機制

0.05、0.15和0.25 mg/ml 比沙可啶組持續(xù)腔內灌注引發(fā)LDCs，在浴槽內加入2×105mol/L TTX 后LDCs 消失。見圖2A、B。

表1 不同濃度比沙可啶組家兔近端結腸LDCs 比較 （n=6）

表2 各組家兔近端結腸快速收縮運動比較 （n=6）

表3 各組家兔近端結腸袋狀收縮運動比較 （n=6）

TTX 組給予TTX 約1 min 后除了微小波，其他運動模式均消失，再以0.05、0.15 和0.25 mg/ml 比沙可啶持續(xù)腔內灌注不能恢復上述運動模式，提示比沙可啶通過神經源性機制對家兔近端結腸發(fā)揮促動力作用。見圖2C～E。

圖2 比沙可啶引發(fā)的家兔結腸LDCs 被TTX 抑制

3 討論

本研究發(fā)現，持續(xù)腔內灌注比沙可啶引發(fā)的LDCs 可被TTX 阻斷。當TTX 致結腸神經系統(tǒng)嚴重損害時，比沙可啶不再引發(fā)LDCs，提示比沙可啶通過神經源性機制對家兔近端結腸發(fā)揮促動力作用。

在家兔結腸中，LDCs 運動與強有力推進性腔內壓力波改變有關[3]，且自發(fā)性LDCs 較少。許多學者通過高清人結腸測壓研究發(fā)現，家兔運動模式與人結腸運動模式基本相似[6-8]。因此，筆者認為家兔結腸LDCs 等同于人結腸HAPW，或稱為高振幅推進性收縮（high amplitude propulsive contractions,HAPCs）[9-11]、高振幅推進性序列[7]。本實驗發(fā)現，強有力的LDCs常造成伴隨其他運動模式（除了微小波）減弱，甚至消失[2，4，12]。人結腸HAPW 運動亦引起其他正在進行的運動模式，如同步壓力波、袋狀運動等被抑制，當然這并不是絕對的[11]。這可能是因為不是所有運動模式可以共存，其使用的可能是部分相同的腸神經元電路。在本實驗條件下，比沙可啶可快速充滿近端結腸腸腔，然而運動模式卻起源于近端結腸，這可能是因為比沙可啶產生LDCs 的信號傳導機制存在于整段近端結腸中。加入TTX 后，僅微小波未被阻斷，家兔結腸中的微小波活動與在小鼠結腸非常相似，都具有很強的節(jié)律性，以及向口端和肛端傳播間切換的混亂方式，表明微小波通過黏膜下神經叢相關的Cajal 間質細胞網絡（the interstitial cells of Cajal associated with the submuscular plexus,ICC-SMP）起搏[13-15]。微小波存在多個起搏點，使慢波在2 個方向上傳播，但這并不是ICC-SMP 任意起搏活動造成的結果，而是振蕩器輸出的自然表達，改變細胞與細胞的耦合程度，極大地改變方向[13-15]。

在目前實驗條件下，比沙可啶作用下的LDCs 可被非選擇性神經阻斷劑——TTX 抑制，但在人離體平滑肌條早期實驗中，比沙可啶或其活性代謝產物4，4-（2-吡啶亞甲基）二苯酚醋酸酯引發(fā)的尖峰樣或張力性收縮不能被TTX 阻斷[16-17]，這可能是因為肌條實驗條件下不能獨立分析各運動模式，如微小波的運動也會干預肌條收縮張力。通過預處理TTX，模擬結腸神經受損，比沙可啶不再引發(fā)LDCs，表明腸神經系統(tǒng)是其產生的必要條件之一。前期研究發(fā)現，肌間神經叢相關性Cajal 間質細胞（ICC associated with the myenteric plexus,ICC-MP）是大鼠結腸產生刺激依賴性的低頻率收縮的起搏器，另外ICC-MP 與小鼠[18-19]（0.3～2.0 次/min）和離體人結腸[20]（0.3～0.6 次/min）低頻收縮活性相關，擴張和神經活動可能是其刺激源。近期有研究發(fā)現，比沙可啶可使慢性傳輸型便秘（chronic transit constipation,STC）患者的Cajal 間質細胞數增加[21]，因此比沙可啶引發(fā)LDCs 可能與ICC-MP 有關。

BORRELLI 等[22]發(fā)現，結腸腔內給高劑量比沙可啶（40 mg）與低劑量比沙可啶（20 mg）相比，高劑量組可提高完整HAPCs 和平均HAPCs 的比例。本實驗發(fā)現，0.15 和0.25 mg/ml 比沙可啶組引發(fā)LDCs 頻率高于0.05 mg/ml 比沙可啶組，因此適度高劑量比沙可啶可以提高STC 患者人結腸測壓的診斷率，但最合適的劑量及其安全性需進一步研究。MITZNEGG 等[16]發(fā)現，比沙可啶引起結腸收縮需較長的潛伏期。本實驗中，需持續(xù)腔內灌注（27.33±4.76）min 比沙可啶才能引發(fā)LDCs，表明比沙可啶不是直接作用于結腸，而是通過分解為活性代謝產物發(fā)揮作用。

近幾年高分辨率人結腸測壓技術進展迅速，讓大家更好地了解結腸動力功能障礙性疾病的病理生理改變。GIORGIO 等[11]發(fā)現，慢性難治性便秘患者對比沙可啶和進食的反應減弱。CORSETTI 等[23]發(fā)現,難治性便秘患者同時存在壓力波減少。CHEN 等[24]發(fā)現，在依賴瀉藥的慢性便秘患者中，多種運動模式對刺激的正常反應性減弱，因此測試人結腸功能異常的一個挑戰(zhàn)是需要最佳的刺激參數來評估患者是否能正常反應。通過觀察刺激的反應性，預測結腸病理生理 改變。

總之，比沙可啶通過神經源性機制引發(fā)家兔近端結腸LDCs，促進結腸傳輸。當規(guī)律的LDCs 發(fā)生時，同步發(fā)生的其他運動模式，如袋狀收縮和快速收縮運動被抑制；0.15 和0.25 mg/ml 比沙可啶引發(fā)的LDCs頻率高于0.05 mg/ml 比沙可啶。本實驗在指導比沙可啶的臨床應用方面具有重要價值。