基于PI3K/Akt/mTOR 信號通路研究南葶藶子水提液對心力衰竭模型大鼠心室重構的影響

楊 明 董竹琴 羅 穎 孫志強 林冬銘 黃抒偉

心力衰竭是各種心臟結構或功能性疾病導致心室充盈及（或）射血能力受損而引起的一組臨床綜合征，常表現(xiàn)為呼吸困難、乏力和體液潴留[1]，屬中醫(yī)“心悸”、“痰飲”、“水腫”等范疇。南葶藶子為十字花科 植 物 播 娘 蒿Descurainia sophia （L.）Webb. ex Prantl.（DSW）的干燥成熟種子，具有強心、利尿、止咳和抑制炎癥滲出等作用[2]。既往研究表明，南葶藶子水提液能改善壓力后負荷所致的心室重構從而改善心功能[3]，但具體機制尚不明確，可能與抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）和交感神經(jīng)激活有關[4-5]。我們通過大鼠心超等前期實驗也證實，南葶藶子水提液具有抑制心室重構、改善心功能的作用[6]。本實驗延續(xù)腹主動脈不完全結扎制造大鼠慢性心衰模型，基于PI3K/Akt/mTOR 信號通路進一步探討南葶藶子水提液改善心衰大鼠心室重構的相關機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠15 只，體質量（220±10）g，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心提供，動物生產(chǎn)單位為上海西普爾必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0016。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18～29℃，日溫差≤3℃，相對濕度達40%～70%，新鮮空氣換氣次數(shù)10 次/h，氣流速度≤0.18m/s，壓差25Pa，潔凈度一萬級，噪音≤60dB，照度150～300Lux。試驗中所有實驗動物飼養(yǎng)、使用和操作均按3R 原則給予人道關懷。

1.2 主要藥物和試劑 南葶藶子由浙江中醫(yī)藥大學提供，取南葶藶子200g，8 倍量70℃水浴提取3 次，每次1h，合并濾液濃縮至100mL 備用，每1mL 相當于2g 原生藥。廣譜磷酸酶抑制劑混合物（貨號AR1183）和熒光二抗（貨號BA1020）均購自博士德生物工程有限公司；Cleaved-caspase-3 抗體（貨號9662S）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（貨號5174S）、B 淋巴細胞瘤-2 蛋白（Bcl-2）抗體（貨號3498S）、Bcl-2 相關x 蛋白（Bax）抗體（貨號2774S）、蛋白激酶B（Akt）抗體（貨號9272S）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）抗體（貨號4685S）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗體（貨號2971S）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）抗體（貨號2972S）均購自Cell Signaling Technology 公司；超敏化學發(fā)光（Ultra ECL）試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司（批號A8262103V）。

1.3 動物分組和模型建立 15 只SD 大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組和南葶藶子組，每組5只。正常組及模型組大鼠給予5mL·kg-1·d-1生理鹽水灌胃，葶藶子組大鼠給予南葶藶子水提液10g·kg-1·d-1灌胃，SD 大鼠動物模型建立后各灌胃4 周。SD 大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉，劍突下腹正中偏左0.5cm切口，打開腹腔，鈍性游離腹主動脈，將一個去掉針尖的8 號注射針頭緊貼腹主動脈平行放置并用4 號線一起結扎，輕輕抽出針頭，使腹主動脈截面積縮窄為原來的50%～60%，撒少許青霉素粉后關腹，分層縫合。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 心室肥厚指數(shù) 大鼠處死后，打開胸腔，迅速分離大鼠心臟，剪去心室底部血管及心房組織，用生理鹽水沖洗心腔內殘留血液，濾紙吸干水分，電子分析天平秤取心室重量，計算心室肥厚指數(shù)。心室肥厚指數(shù)=心室質量（g）/大鼠體質量（g）。

1.4.2 病理組織形態(tài)學檢測 取左心室心肌標本，置于4%甲醛中固定24h，經(jīng)取材、脫水、石蠟包埋處理后，沿左心室長軸線取4μm 厚度切片，HE 染色后光學顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學變化。

1.4.3 電鏡觀察 取左心室心肌組織，4℃下用2.5%戊二醛固定過夜，然后用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，用1%四氧化鋨固定2h。使用未涂布的銅網(wǎng)格上的超小型標準程序獲得3 個超薄切片，并用0.2%檸檬酸鉛/1%乙酸鈾酰染色。通過透射電子顯微鏡（JOEL-1400EX，日本東京）記錄圖像，放大倍數(shù)20000×觀察。

1.4.4 Western Blot 法檢測 取大鼠左心室心肌組織標本液氮研碎，加入裂解液，經(jīng)勻漿離心后，取上清液用BCA 法測定蛋白濃度，變性后-20℃保存。取各組樣本50μg，進行12%SDS-PAGE 并濕轉至PVDF 膜上，用3%BSA 室溫搖床封閉2h，加入3%封閉液稀釋的抗體（1：1000 稀釋），4℃冷庫搖床過夜，用TBST 洗滌15min×3 次。然后，加入二抗（1：2000 稀釋），室溫下?lián)u床孵育2h 后，用TBST 洗滌15min×3次。ECL 發(fā)光液顯色，膠片掃描后用Imgae J 軟件進行圖像分析，以GAPDH（1：1000 稀釋）作為內參照對比，比值結果表示其蛋白的相對含量。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s） 表示，采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 模型組大鼠造模后出現(xiàn)活動量下降，呼吸稍急促，4 周后體質量較正常組明顯下降（P＜0.05），南葶藶子組大鼠體質量較模型組有所增加（P＜0.05）。4 周后，模型組大鼠較正常組心室增重，心室肥厚指數(shù)升高，南葶藶子組大鼠心室重量、心室肥厚指數(shù)較模型組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 心室組織病理結果 正常組大鼠心肌纖維組織排列規(guī)則，心肌纖維無明顯斷裂。模型組大鼠心肌纖維排列不規(guī)則，且出現(xiàn)纖維斷裂、肥厚現(xiàn)象，組織間隙伴有炎性細胞浸潤。南葶藶子組與模型組比較，上述情況明顯改善。見插頁圖1。

表1 各組大鼠體質量、心室質量及心室肥厚指數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠體質量、心室質量及心室肥厚指數(shù)比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；正常組及模型組大鼠給予生理鹽水灌胃，南葶藶子組大鼠給予南葶藶子水提液灌胃

組別正常組模型組南葶藶子組鼠數(shù)555體質量（g）313.70±7.57 285.03±5.39*295.13±5.39△心室質量（g）0.92±0.28 1.07±0.05*0.96±0.09△心室肥厚指數(shù)0.0029±0.0001 0.0037±0.0001*0.0033±0.0002△

2.3 心室組織電鏡結果 正常組大鼠心肌纖維排列整齊，z 線清晰均勻，線粒體嵴緊密有序。模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，z 線消失，甚至破裂；線粒體數(shù)量增加，但形態(tài)不一，膜結構不清、融合甚至消失；可觀察到線粒體空泡化和腫脹。南葶藶子組與模型組比較，這些病理改變明顯改善。見插頁圖2。

2.4 各組大鼠左心室心肌組織蛋白表達比較 與正常組比較，模型組大鼠心肌組織Bax 和Caspase-3 蛋白表達上調，Bcl-2 蛋白表達下調；與模型組比較，南葶藶子組大鼠心肌組織Bcl-2/Bax 表達上調，caspase-3 蛋白表達下調（P 均＜0.05）；與模型組比較，南葶藶子組大鼠心肌組織p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 蛋白表達上調（P＜0.05）。見表2、插頁圖3。

3 討 論

研究表明，高血壓的主要靶器官（心、腦、腎）中均存在細胞凋亡現(xiàn)象[7]，且心肌細胞凋亡已被證明可發(fā)生在心力衰竭心臟中[8]，許多心衰進展的病理生理因素，如兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）、炎癥因子和機械壓力等均可促進心肌細胞凋亡[9]。南葶藶子含有牛磺酸成分，具有抗氧化、調節(jié)兒茶酚胺及AngⅡ的水平[10]，改善心臟能量代謝的作用[11]。南葶藶子亦可通過利尿排泄腎臟毒性物質（如硫酸鹽）間接抑制心肌細胞凋亡和改善心室肥厚[2]。

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡[12]，Bcl-2 家族和caspase 家族在細胞凋亡轉導途徑中起著非常重要的調節(jié)作用，尤其是在線粒體途徑中。Bcl-2 和Bax 基因家族是線粒體膜通透性改變的重要調節(jié)基因，其過表達可以控制上游cyt-c 的釋放和下游caspase-3 蛋白酶的活化并介導細胞凋亡[13]。本研究通過電鏡證實南葶藶子組心肌細胞線粒體損傷減輕。Western blot 結果顯示，與模型組比較，南葶藶子組大鼠心肌組織Bcl-2/Bax 蛋白表達上調，caspase-3蛋白表達下調，說明南葶藶子水提液可能是通過Bcl-2/Bax 介導的線粒體凋亡信號傳導途徑抑制心肌凋亡。

表2 各組大鼠心肌組織蛋白灰度值比較（x±s）

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian aarget of rapamycin，mTOR）是一種進化上相對保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過磷酸化其下游的靶蛋白，參與基因的轉錄和蛋白的表達，進而影響凋亡等生物活性。而相關細胞因子又可通過受體酪氨酸激酶激活PI3K，活化的PI3K 催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）轉化為PIP3，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）的協(xié)同下磷酸化Akt 使其激活。活化的Akt 磷酸化TSC2，而被磷酸化的TSC2 將阻止其對小G 蛋白Rheb 的負調控，從而正向調控mTOR 活性[14]。本研究結果證實，隨著壓力后負荷性心衰模型的進展，南葶藶子組較模型組p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 蛋白表達上調（P＜0.05），凋亡蛋白caspases-3表達下調，說明南葶藶子提取液抑制心肌細胞凋亡可能與激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路有關。

綜上所述，本研究證實南葶藶子能有效改善壓力負荷性心衰大鼠心室重構，作用機制可能與激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路抑制心肌細胞凋亡有關。本研究的局限性在于缺乏原代心肌細胞實驗，未使用mTOR 抑制劑雷帕霉素反向驗證南葶藶子抑制心肌細胞凋亡是通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路介導。另外，由于本研究樣本量較小，為了驗證本研究結論的準確性，可能需要進一步擴大樣本量進行進一步研究。