血清miRNA-10a 與IL-35 水平對膿毒癥誘導(dǎo)急性腎損傷患者預(yù)后評估價值

朱先華

膿毒癥是一種嚴(yán)重危及生命、預(yù)后較差的臨床危重癥，短期預(yù)后死亡率近三分之一[1]。膿毒癥患者由于全身炎性反應(yīng)綜合征，誘發(fā)多器官功能障礙綜合征，最后導(dǎo)致多器官功能衰竭，其中膿毒癥導(dǎo)致的急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）最為多常見，也是導(dǎo)致患者預(yù)后結(jié)局不良的主要病因之一[2]。尋找有效、便捷的早期診斷及判斷預(yù)后的血清學(xué)指標(biāo)，對于臨床有效阻止膿毒癥誘導(dǎo)AKI 的發(fā)生，改善患者預(yù)后具有重要意義[3]。目前臨床常用降鈣素原（procalcitonin，PCT）、腎損傷分子1（kidney injury molecule-1，KIM-1）、胱抑素C（cystatin C，Cys-C）、序貫器官衰竭評分（sequential organ failure assessment，SOFA）等指標(biāo)來早期評估膿毒癥誘導(dǎo)AKI 發(fā)生，但是對于評估患者病情及預(yù)后的準(zhǔn)確度較差，因此尋找更準(zhǔn)確的血清指標(biāo)仍是臨床熱點問題[4]。臨床研究顯示，微小RNA-10a（miRNA-10a）及白細(xì)胞介素-35（interleukin-35，IL-35）對于膿毒癥病情評估具有一定的臨床價值[5]，但是血清miRNA-10a 及IL-35 水平對膿毒癥誘導(dǎo)AKI 患者預(yù)后的評估價值尚未見報道，故本研究對此探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016 年6 月—2018 年6 月在浙江省臨海市第一人民醫(yī)院ICU 住院治療的膿毒癥患者90 例作為研究對象，其中男44 例，女46 例，平均年齡（56.7±10.9）歲；所有研究對象按有無AKI 發(fā)生分為兩組，觀察組42 例，對照組48 例。本研究符合臨床試驗研究法規(guī)及赫爾辛基宣言，通過本院倫理委員會審核，未對研究對象造成有害或不利的損害，研究結(jié)果對患者診療有益，納入研究過程完全尊重患者或其直系親屬及監(jiān)護(hù)人的意見，研究過程中遵從自愿原則。患者直系親屬或監(jiān)護(hù)人均書面簽署知情同意書。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合2001 年國際膿毒癥釋義會議確定的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；（2）符合阿姆斯特丹AKI 合作研究會確定的AKI 診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有自身免疫性疾病或接受免疫調(diào)節(jié)治療；（2）合并惡性腫瘤晚期或嚴(yán)重臟器功能不全；（3）研究期內(nèi)不能堅持隨訪，臨床資料不完整者。

1.3 血清標(biāo)記物檢測 兩組患者檢查時間點選擇為入院即刻、治療后第3、7、14 及28 天，均于清晨空腹抽外周血3～5mL，應(yīng)用2000r/min 轉(zhuǎn)速離心10min，分離得血清采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測樣本IL-35 以及PCT 濃度，測定IL-35 以及PCT 所用ELISA 試劑盒均購自美國BD 公司，操作流程依據(jù)ELISA 試劑盒說明書逐步進(jìn)行。采用免疫比濁法測定血清Cys-C水平，采用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定血清KIM-1 水平，Cys-C 及KIM-1 測定試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司。血清肌酐（serum creatinine，Scr）濃度由檢驗科用全自動生化分析儀檢測。

1.4 血清miRNA-10a 檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測血清miRNA-10a 表達(dá)水平。兩組患者均于入院即刻、治療后第3、7、14 及28 天，抽取5mL 外周血樣本，采用miRNA 檢測試劑盒（購自美國Invitrogen 公司）提取血清miRNA，再采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自美國Fermentas 公司）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 鏈，依據(jù)檢測試劑盒說明書進(jìn)行具體操作流程。內(nèi)參為小核RNA U6（snRNA U6），上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGC ACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCG T-3’。miRNA-10a 上游引物：5’-GGAGGGGTACCAGAATCCCATTTTGGCCA-3’，下游引物：5’-GGAGG AAGCTTGCGGAGTGTTTATGTCAACT-3’。

PCR 反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說明書確定，具體為：預(yù)變性95℃、5min；95℃、10s 變性，60℃、20s退火，72℃、20s 延伸，40 個循環(huán)。以2-ΔΔCt 表示觀察組miRNA-10a 相對于對照組的表達(dá)水平，ΔCt=Ct目標(biāo)-Ct 內(nèi)參。

1.5 序貫器官衰竭評分 兩組均進(jìn)行全身性感染相關(guān)性器官功能衰竭評分（sepsis related organ failure assessment，SOFA），主要分為呼吸（PaO2/FiO2、呼吸支持）、凝血系統(tǒng)（血小板）、肝功能（膽紅素）、循環(huán)系統(tǒng)（平均動脈壓、多巴胺、腎上腺素、去甲腎腺素、多巴酚丁胺劑量）、神經(jīng)系統(tǒng)評分、腎臟系統(tǒng)（肌酐、24h 尿量）六部分組成，其中每項分值為0～4 分，總分值0～48 分，分?jǐn)?shù)越高，預(yù)后越差。SOFA 評分由兩名ICU專科副主任醫(yī)師進(jìn)行評估。

1.6 預(yù)后分析 所有納入研究患者出ICU 后均通過電話詢問方式隨訪3 個月，隨訪間隔1 個月。記錄死亡例數(shù)以及各自死亡原因，其中死亡主要原因為多器官功能衰竭12 例、急性腎衰竭9 例、全身炎癥反應(yīng)8 例、DIC 5 例。根據(jù)患者隨訪期間預(yù)后結(jié)局分為兩組，生存組56 例，死亡組34 例。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布且齊性檢驗的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，不同時間點血清指標(biāo)動態(tài)水平比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，生存組與死亡組治療第1天血清miRNA-10a 與IL-35 水平比較采取成組t 檢驗。計數(shù)資料以頻次或百分比表示，比較采用χ2檢驗。采用Pearson 相關(guān)分析分別評估血清miRNA-10a、IL-35 與PCT、Scr、KIM-1、Cys-C 及SOFA 評分間的相關(guān)性。應(yīng)用多元Logistic 回歸分析上述指標(biāo)與生存率的相關(guān)性。應(yīng)用受試者工作特征曲線（ROC）方法評估血清miRNA-10a 與IL-35 水平對患者預(yù)后的評估價值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較 觀察組42 例，男20 例，女22 例，平均年齡（55.1±8.8）歲，體質(zhì)指數(shù)（BMI，18.7±2.1）kg/m2；對照組48 例，男24 例，女24 例，平均年齡（57.7±11.3）歲，BMI（17.9±1.5）kg/m2。兩組患者年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 兩組膿毒癥誘導(dǎo)急性腎損傷患者不同時間點血清指標(biāo)動態(tài)水平比較（x±s）

表2 膿毒癥誘導(dǎo)AKI 患者各指標(biāo)相關(guān)性分析

2.2 兩組不同時間點血清指標(biāo)水平比較 與入院即刻比較，對照組不同時間點間血清PCT 及SOFA 評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05），血清miRNA-10a、IL-35、Scr、KIM-1、Cys-C 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）；觀察組不同時間點間血清miRNA-10a、IL-35、PCT、Scr、KIM-1、Cys-C 及SOFA 評分自治療第3 天始隨治療時間延長逐漸降低（P 均＜0.05）；觀察組與對照組各時間點血清miRNA-10a、IL-35、Scr、KIM-1 及Cys-C 水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05），觀察組各時間點血清PCT 水平、SOFA 評分與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.3 相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)分析顯示，膿毒癥誘導(dǎo)AKI 患者血清miRNA-10a、IL-35 分別與血清KIM-1、Cys-C 正相關(guān)（r=0.781，P=0.032、r=0.835，P=0.027；r=0.842，P=0.026、r=0.864，P=0.024），見表2。

2.4 生存組與死亡組指標(biāo)比較 生存組血清miRNA-10a 與IL-35 水平顯著低于死亡組（P 均＜0.05），見表3。

2.5 與生存率相關(guān)因素多元Logistic 回歸分析 以隨訪3 個月生存率為應(yīng)變量，血清miRNA-10a、IL-35、PCT、Scr、KIM-1、Cys-C、SOFA 評分為自變量，應(yīng)用全模型多元Logistic 回歸分析方法進(jìn)行回歸分析，結(jié)果顯示，血清miRNA-10a（OR=3.157，P=0.016）與IL-35（OR=2.426，P=0.027）為膿毒癥誘發(fā)AKI 患者預(yù)后危險因素，見表4。

表3 生存組與死亡組治療后第3 天血清指標(biāo)比較（x±s）

2.6 血清miRNA-10a 與IL-35 聯(lián)合診斷的ROC 曲線分析 應(yīng)用ROC 曲線評估治療第1 天血清miRNA-10a 與IL-35 預(yù)測膿毒癥誘發(fā)AKI 患者的隨訪3 個月預(yù)后不良的價值，結(jié)果顯示，血清miRNA-10a截斷值為3.15，預(yù)測膿毒癥誘導(dǎo)AKI 患者隨訪3 個月預(yù)后不良發(fā)生的曲線下面積（AUC）為0.783，P 值為0.042，靈敏度77.9%（95%CI：0.733～0.835），特異度82.6%（95%CI：0.793～0.854）；血清IL-35 截斷值為355pg/mL，預(yù)測隨訪3 個月預(yù)后不良的AUC 為0.806，P 值為0.037，靈敏度77.9%（95%CI：0.733～0.835），特異度90.1%（95%CI：0.733～0.835）；血清miRNA-10a 與IL-35 聯(lián)合檢測預(yù)測膿毒癥誘導(dǎo)AKI患者隨訪3 個月預(yù)后不良發(fā)生的AUC 為0.852，P 值為0.032，其預(yù)測短期預(yù)后不良的靈敏度為85.6%（95%CI：0.810～0.924），特異度為87.9%（95%CI：0.826～0.941），見圖1。

表4 臨床指標(biāo)多元Logistic 回歸分析比較

圖1 治療前血清miRNA-10a 與IL-35 水平預(yù)測膿毒癥誘導(dǎo)AKI 患者預(yù)后的ROC 曲線

3 討 論

膿毒癥患者體內(nèi)內(nèi)毒素以及過量炎癥介質(zhì)破壞凝血-纖溶系統(tǒng)平衡，促使腎臟微血管內(nèi)形成微血栓，降低腎小球灌注壓及濾過率，導(dǎo)致AKI 發(fā)生[8]。膿毒癥早期腎功能損害是可逆，但進(jìn)展迅速，腎實質(zhì)損害嚴(yán)重且不可逆，即便全面支持對癥處理也不能改善患者預(yù)后，因此膿毒癥誘導(dǎo)AKI 治療的關(guān)鍵是早期預(yù)測、及早發(fā)現(xiàn)高危患者，在腎功能損害早期即予以充分有效治療措施，能有效逆轉(zhuǎn)腎功能，改善臨床癥狀及短期預(yù)后[9]。

miRNA-10a 是調(diào)控膿毒癥免疫應(yīng)答水平的關(guān)鍵因子之一，其水平高低直接關(guān)系到患者病情發(fā)展及預(yù)后，且早期評估膿毒癥病情及預(yù)后具有較好特異性和敏感性[9-10]。國外研究顯示，miRNA-10a 能調(diào)節(jié)輔助性T 細(xì)胞比例，提高TNF-α 及IL-2 等炎性因子水平，調(diào)節(jié)整體免疫網(wǎng)絡(luò)[11-12]。miRNA-10a 表達(dá)異常與膿毒癥誘發(fā)AKI 的免疫失衡程度存在相關(guān)性，因此被認(rèn)為是今后膿毒癥誘發(fā)AKI 的重要治療靶點[13]。IL-35 是機體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞因子之一，能有效地改善多種炎癥疾病病情，延緩進(jìn)展。IL-35 能抑制機體炎癥反應(yīng)，平衡特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)[14-15]。膿毒癥患者循環(huán)IL-35 能抑制IL-2與IFN-γ 生成，上調(diào)IL-10 分泌及調(diào)節(jié)型T 細(xì)胞比例，對過度激活免疫系統(tǒng)起到抑制效應(yīng)，因此被認(rèn)為是膿毒癥誘導(dǎo)AKI 治療的重要血清標(biāo)志物[16-18]。

本研究結(jié)果顯示，在治療后四個時間點，兩組血清miRNA-10a、IL-35、Scr、KIM-1 及Cys-C 水平均存在差異，且觀察組均高于對照組（P＜0.05），提示血清miRNA-10a 與IL-35 水平能反映膿毒癥患者可能發(fā)生AKI。隨著治療持續(xù)進(jìn)行，各項血清指標(biāo)水平也呈進(jìn)行性降低，存在治療時間的差異性，提示血清miRNA-10a 與IL-35 動態(tài)改變與膿毒癥誘發(fā)AKI病情可能存在一定關(guān)系，這為監(jiān)測兩種指標(biāo)水平變化來指導(dǎo)治療方案提供臨床依據(jù)[19]。目前臨床評估AKI 病情的血清學(xué)指標(biāo)多為KIM-1 及Cys-C，本研究直線相關(guān)分析顯示，血清miRNA-10a 與IL-35 水平與血清KIM-1 及Cys-C 均呈正相關(guān)。因此血清miRNA-10a 與IL-35 對評估膿毒癥誘發(fā)AKI 病情具有較好臨床價值。Scr 與SOFA 評分兩組患者無顯著差異，同時與血清miRNA-10a 與IL-35 水平也無相關(guān)性，提示臨床通過檢測血清Scr 與SOFA 評分難以評估AKI 的發(fā)生[20]。

通過短期3 個月隨訪，生存組治療后第1 天的血清miRNA-10a 與IL-35 水平低于死亡組，提示治療早期血清miRNA-10a 與IL-35 水平與患者短期預(yù)后有相關(guān)性。血清miRNA-10a 與IL-35 被多元Logistic 回歸分析證實是膿毒癥誘發(fā)AKI 預(yù)后的危險因素，提示動態(tài)監(jiān)測血清miRNA-10a 與IL-35 能早期評估膿毒癥誘發(fā)AKI 患者生存狀況。本研究也證實，單用血清miRNA-10a 或IL-35 預(yù)測膿毒癥誘發(fā)AKI 患者的短期預(yù)后臨床價值不理想，而兩者聯(lián)合檢測的敏感性和特異性提高明顯，因此診斷價值更高。