急性顱腦損傷患者外周血Th17/Treg 細胞及相關(guān)細胞因子表達及意義

劉飛飛 韓麗君 鮑光明 李 軍

急性顱腦損傷是神經(jīng)外科常見疾病之一。研究表明，急性顱腦損傷后的免疫炎性反應(yīng)在繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg 細胞失衡與自身免疫性疾病[2]、腦出血[3]、腦梗死[4]、腦動脈瘤[5]和帕金森病[6]等多種疾病關(guān)系密切，急性顱腦損傷可導(dǎo)致白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）等細胞因子的異常表達[7]。然而，目前關(guān)于Th17/Treg 細胞平衡與急性顱腦損傷程度關(guān)系的研究仍較少。因此，本研究通過觀察不同程度急性顱腦損傷患者及健康體檢者外周血Th17/Treg 細胞比例差異，并檢測血清相關(guān)細胞因子IL-17、IL-23、TGFβ1 表達水平，探討Th17/Treg 細胞平衡與急性顱腦損傷的關(guān)系，為急性顱腦損傷的病情評估及預(yù)后判斷提供參考。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2015 年1 月—2016 年12 月在杭州市中醫(yī)院神經(jīng)外科住院治療的104 例急性顱腦損傷非手術(shù)患者作為研究對象。格拉斯哥昏迷量表（Glasgow coma scale，GCS）評分由兩位有經(jīng)驗的神經(jīng)外科醫(yī)師判定，根據(jù)GCS 評分量表進行分組[8]：GCS13～15 分為輕型顱腦損傷組34 例，GCS9～12 分為中型顱腦損傷組38 例，GCS3～8 分為重型顱腦損傷組32 例，另選取同期在杭州市中醫(yī)院體檢中心體檢的健康人30 名為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，所有參與者受試前均簽署知情同意書。

1.2 診斷標準 急性顱腦損傷診斷參照《臨床診療指南神經(jīng)外科學(xué)分冊》[9]及文獻[10]診斷標準：（1）患者因外傷導(dǎo)致顱腦損傷；（2）入院時間不超過外傷發(fā)生后12h；（3）頭顱CT 和（或）核磁共振等影像學(xué)檢查提示點片狀高密度影，或者高、低密度影相兼。

1.3 納入及排除標準 納入標準：（1）年齡18～75歲；（2）所有患者均符合上述診斷標準，且傷后6h 內(nèi)來院就診；（3）GCS 評分3～15 分。排除標準：（1）傷前明確有免疫疾病或嚴重感染者；（2）妊娠及哺乳期者；（3）近8 周內(nèi)服用過免疫抑制劑者；（4）合并其他臟器嚴重損傷，或合并有嚴重基礎(chǔ)性疾病（如心、肺、肝、腎功能異常者）。

2 方 法

2.1 標本采集 各組顱腦損傷患者入院后次日清晨抽取空腹靜脈血8mL 于肝素鈉抗凝管中，對照組血液標本由我院體檢中心提供。其中3mL 靜脈血，3000r/min 離心10min，取上層血清置-80℃冰柜冷凍保存待用于EILSA 檢測。另5mL 靜脈血用Ficoll 密度梯度離心后分離外周單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），用于 流 式 細胞 術(shù) 檢 測Th17 細胞、Treg 細胞。

2.2 外周血Th17 細胞、Treg 細胞檢測 流式細胞術(shù)的檢測參考文獻，使用Beckman coulter cell 多色流式細胞儀，以CD4+IL-17+代表Th17 細胞，以CD4+CD25+Foxp3+代表Treg 細胞，分析Th17 細胞和Treg細胞的含量。流式分析相關(guān)抗體均購自美國BD 公司。

2.3 血清IL-17、IL-23、TGF-β1 表達水平測定 按人IL-17、IL-23、TGF-β1 ELISA 試劑盒說明書進行操作（上海藍基生物科技有限公司，批號20161010）。在450nm 處測定各標本OD 值，以O(shè)D 值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，根據(jù)標準曲線計算出各樣品IL-17、IL-23、TGF-β1 表達水平。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析處理。計量資料以均數(shù)±標準差（±s） 表示，計量資料如符合正態(tài)分布多組間比較采用單因素方差分析，若差異有顯著性，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，如不符合正態(tài)分布或方差不齊采用非參數(shù)檢驗，取雙側(cè)檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 四組一般資料比較 輕型顱腦損傷組34 例，男18 例，女16 例，年齡為26～74 歲，平均（48.06±13.08）歲；中型顱腦損傷組38 例，男20 例，女18 例，年齡29～73 歲，平均（49.81±14.48）歲；重型顱腦損傷組32 例，男17 例，女15 例，年齡25～75 歲，平均（47.34±12.99）歲；對照組30 名，男15 名，女15 名，年齡24～72 歲，平均（46.23±13.71）歲。四組性別、年齡等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

3.2 各組外周血Th17 細胞、Treg 細胞百分率比較急性顱腦損傷患者外周血Th17 細胞百分率高于對照組（P＜0.05），重型顱腦損傷組明顯高于輕型和中型顱腦損傷組（P＜0.05），中型顱腦損傷組明顯高于輕型顱腦損傷組（P＜0.05）；中重型顱腦損傷患者外周血Treg 細胞百分率低于對照組（P＜0.05），重型顱腦損傷組低于輕型和中型顱腦損傷組（P＜0.05），中型顱腦損傷組低于輕型顱腦損傷組（P＜0.05）。與對照組比較，輕型顱腦損傷患者外周血Treg 細胞百分率降低不明顯（P＞0.05），見表1。

表1 健康對照者與急性顱腦損傷患者外周血Th17 細胞、Treg 細胞百分率比較（%，x±s）

3.3 各組血清IL-17、IL-23、TGF-β1 表達水平比較

急性顱腦損傷患者血清IL-17、IL-23 水平均高于對照組（P＜0.05），重型顱腦損傷組高于輕型和中型顱腦損傷組（P＜0.05），輕型顱腦損傷組的IL-17、IL-23 水平最低；中重型顱腦損傷患者血清TGF-β1 水平低于對照組（P＜0.05），重型顱腦損傷組低于輕型和中型顱腦損傷組（P＜0.05），中型顱腦損傷組低于輕型顱腦損傷組（P＜0.05）。與對照組比較，輕型顱腦損傷患者血清TGF-β1 水平降低不明顯，見表2（P＞0.05）。

表2 健康對照者與急性顱腦損傷患者血清IL-17、IL-23、TGF-β1 表達水平比較（pg/mL，x±s）

4 討 論

研究證實，急性顱腦損傷后的血腦屏障破壞、炎性反應(yīng)、自由基損傷等可加重神經(jīng)功能受損，從而導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷[12]。其中免疫炎性反應(yīng)在急性顱腦損傷中的作用尤為重要。Treg 細胞作為內(nèi)源性負性免疫調(diào)節(jié)細胞可減輕腦缺血后再灌注損傷、抑制腦出血后免疫炎性反應(yīng)，對腦細胞起到保護作用[13-14]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，蛛網(wǎng)膜下腔出血、顱內(nèi)動脈瘤破裂和腦疝均導(dǎo)致患者血清Treg 細胞含量降低[15]。Th17/Treg 細胞在人體中相對平衡，在維持機體的免疫平衡狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。但當機體出現(xiàn)腦梗死、帕金森或自身免疫疾病等情況時，Th17/Treg 細胞的平衡被打破，造成人體細胞因子網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)平衡被破壞，進而引起疾病的發(fā)生和發(fā)展[16]。

本研究結(jié)果顯示，急性顱腦損傷患者外周血Th17 細胞水平明顯高于對照組，且腦損傷程度越重其升高越明顯；而急性顱腦損傷患者外周血中Treg細胞水平低于對照組，且重型顱腦損傷患者降低最明顯。該結(jié)果表明，Th17 過亢及Treg 不足可能與急性顱腦損傷后的腦損傷程度相關(guān)，Th17/Treg 細胞失衡參與急性顱腦損傷后繼發(fā)性腦損傷的過程。

IL-17 是Th17 細胞介導(dǎo)炎性損傷的主要致炎因子，具有募集、動員與活化中性粒細胞的能力，可以促進LI-6、IL-8 等細胞因子釋放，誘導(dǎo)機體發(fā)生免疫損傷[17]。IL-23 能夠增強Th17 細胞的增殖，維持Th17 細胞穩(wěn)定, 并刺激其相關(guān)細胞因子IL-17、IL-6和IL-8 的分泌[18]。IL-23/IL-17 軸通過介導(dǎo)異常免疫炎性反應(yīng)，在急性腦出血[19]、腫瘤[20]、腦梗死[21]和自身免疫性疾病[22]等多種疾病中發(fā)揮作用。TGF-β1 屬于重要的抗炎因子，可促使Treg 細胞分化，在Treg 細胞增殖過程中發(fā)揮作用。TGF-β1 能夠調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)和小膠質(zhì)細胞的增殖、促進細胞修復(fù)和血管生成，具有腦保護的作用[23]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性顱腦損傷患者外周血IL-17、IL-23 水平較對照組明顯升高，且腦損傷程度越重其升高越明顯，表明IL-23/IL-17 軸參與急性顱腦損傷的發(fā)病；而急性顱腦損傷患者外周血TGF-β1水平較對照組降低，且重型顱腦損傷患者降低最明顯。以上結(jié)果進一步證實促炎因子表達增多及抑炎因子表達不足可能與急性顱腦損傷后的腦損傷程度相關(guān)。

綜上所述，Th17/Treg 細胞及其相關(guān)細胞因子是免疫炎性反應(yīng)的重要效應(yīng)因子，Th17/Treg 細胞失衡參與急性顱腦損傷后繼發(fā)性腦損傷過程。檢測Th17/Treg 細胞及其相關(guān)細胞因子水平有助于評估急性顱腦損傷患者病情。