EFNB2 基因rs550067317 位點基因多態性與精神分裂癥相關性研究

汪 斌 項則文 陳 瑩 蔡 靚

精神分裂癥是一種慢性、嚴重和致殘的精神疾病，其臨床特征是幻覺、妄想和認知缺陷，其遺傳度高達80%[1]。EFNB2 基因位于13q33 染色體上，與精神分裂癥有很強的聯系。研究發現，EFNB2 基因與中國漢族人群中的精神分裂癥有關[2]。研究表明，microRNA 表達失調可能與精神分裂癥相關[3-5]。microRNA-137（miR-137）的變異是迄今為止鑒定的與精神分裂癥風險相關性最為密切的基因座之一，與較差的認知表現有關。與miR-137 相關的精神分裂癥風險可能與其更廣泛的下游遺傳效應有關[6]。rs550067317 位于EFNB2 基因的3’-UTR，該區域是miR-137 的結合位點，本研究探討EFNB2 基因rs550067317 位點單核苷酸多態性與精神分裂癥的相關性，同時分析miR-137 的作用，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選擇2015 年8 月—2017 年12月期間浙江省紹興市第七人民醫院精神科收治的85例精神分裂癥患者作為研究對象，選擇同期健康體檢者85 名作為對照，本研究通過醫院倫理委員會的審核，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 精神分裂癥診斷標準 參考美國精神障礙診斷與統計手冊第四版（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disor-ders，DSM-IV）[7]。

1.3 納入、排除標準 納入標準：（1）年齡≥20 歲；（2）有兩名精神科主治醫生根據DSM-IV 標準確診為精神分裂癥。排除標準：（1）根據DSM-IV 診斷為精神發育遲滯、心境障礙、譫妄、分裂情感障礙、癡呆等精神類疾病；（2）有嚴重的臟器功能障礙；（3）處于哺乳期或者妊娠期的患者。

1.4 基因型分析 所有受試者均被抽取約2mL 靜脈血，使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，保存于-20℃冰箱待測。根據美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫中EFNB2 基因rs550067317 位點信息設計引物，上游引 物 序 列 為F：5’-TACTGGCACTAAGATACACAG CTCCGAGCT-3’。下游引物序列為R：5’-GTATCTT AGTGCCAGTACCACAACAGTCCT-3’。使用25μL 的PCR 反應體系擴增，包含50ng 模板DNA，10×PCR緩沖液2.5μL，25mM Mg2+1.5μL，10mM dNTP 0.5μL，5U Taq 酶0.5μL，上下游引物各1μL，補雙蒸水至25μL。PCR 反應程序為：95℃，4min；然后進入30 個循環的如下反應：94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；然后72℃，10min。PCR 反應完成后將產物寄送上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結果使用chromas 1.62 進行序列分析，結果見圖1。

圖1 EFNB2 基因rs550067317 位點測序結果

1.5 血漿miR-137 表達檢測 取2mL 受試者EDTA 抗凝血，使用TRIzol（Invitrogen，USA）提取總RNA，使用反轉錄PCR 反轉錄成cDNA，試劑盒為TaqManmicroRNA 反轉錄試劑盒（ThermoFisher，批號4366596），每個樣本重復測量2 次，以GAPDH 為外參，計算miR-137 的閾值環（threshold cycle，Ct）的差，并用2-△△Ct 表示miR-137 的相對表達水平。GAPDH 反轉錄qPCR 正向引物序列為5’-CCAAGG TCATCCATGACAACT-3’，反向引物為5’-CAGGGA TGATGTTCTGGAGAG-3’。miR-137 反轉錄qPCR 正向引物序列為5’-TTATTGCTTAAGAATACGCGTAG-3’，反向引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’。

1.6 統計學方法 使用SPSS20.0 軟件進行統計分析，計數資料的表示方法為頻數[n（%）]，組間差異采用χ2檢驗，基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡采用χ2檢驗。采用非條件Logistic 回歸模型估計優勢比（OR）和95%置信區間（CI）。計量資料用均數±標準差（s） 表示，組間統計分析采用t 檢驗或單因素方差分析。采用非參數法估計計算受試者工作特征曲線（ROC）曲線下面積（AUC），P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 精神分裂癥患者與健康對照者一般情況比較研究組85 例中男46 例，女39 例，年齡20～74 歲，平均（36.54±9.56）歲。對照組85 名中男42 名，女43名，年齡20～65 歲，平均（36.15±10.12）歲。研究組與對照組年齡、性別等差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 EFNB2 基因rs550067317 位點基因多態性與精神分裂癥風險 EFNB2 基因rs550067317 位點基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。研究組患者與對照組EFNB2 基因rs550067317 位點基因型頻率之間差異有統計學意義（χ2=6.996，P=0.030），以野生型AA 為參考，雜合子（AC）不是精神分裂癥的危險因素（OR=0.492，95%CI=0.203～1.182，P=0.082），純合子（CC）是精神分裂癥發生的保護因子（OR=0.300，95%CI=0.087～0.980，P=0.024），顯性模型下精神分裂癥發生風險降低（OR=0.414，95%CI=0.196～0.870，P=0.011），隱性模型下精神分裂癥風險并未顯著降低（OR=0.346，95%CI=0.102-1.112，P=0.081）。研究組患者EFNB2 基因rs550067317 位點C 等位基因頻率顯著低于對照組，差異有統計學意義（χ2=9.833，P=0.002），以A 等位基因為參考，C 等位基因是精神分裂癥發生的保護因素（OR=0.413，95%CI=0.226～0.750，P=0.002），見表1。

2.3 miR-137 表達情況 RT-PCR 檢測結果顯示，精神分裂癥患者血漿miR-137 水平顯著高于對照組（P＜0.01），見表2。分析比較EFNB2 基因rs550067317位點不同基因型受試者血漿miR-137 水平，結果顯示，AA 基因型受試者血漿miR-137 水平顯著高于AC 基因型、AC 基因型顯著高于CC 基因型（P＜0.01），見表3。

2.4 miR-137 基因表達對精神分裂癥診斷價值 使用Graphpad Prism 7.0 作miR-137 水平診斷精神分裂癥的ROC 曲線，結果顯示，cut-off 值為2.45，即當miR-137 相對表達量為2.45 時診斷精神分裂癥的價值最高，miR-137 診斷精神分裂癥的AUC（曲線下面積）為0.8619，P＜0.0001，敏感度為72.94%，特異度為85.88%。當僅考慮rs550067317 位點野生型（AA）受試者時，miR-137 診斷精神分裂癥的AUC（曲線下面積）為0.9791，P＜0.0001，敏感度為98.53%，特異度為95.59%，cut-off 值為3.75。當僅考慮rs550067317 位點突變型（AC+CC）受試者時，miR-137 診斷精神分裂癥的AUC（曲線下面積）為0.8529，P=0.0004，敏感度為76.47%，特異度為76.47%，cut-off 值為2.25。見圖2。

表1 EFNB2 基因rs550067317 位點基因型和等位基因頻率[例（%）]

表2 研究組和對照組miR-137 相對表達水平比較（x±s）

表3 EFNB2 基因rs550067317 位點不同基因型受試者血漿miR-137 水平比較（x±s）

3 討 論

雖然全基因組關聯研究提供了一種系統的、有效的、無偏移的方法來研究復雜疾病如精神分裂癥的常見變異，然而由于精神分裂癥在不同人群中的遺傳異質性，精神分裂癥易感位點的識別在不同的研究中不能被重復[8-9]。盡管如此，通過病例對照全基因組關聯研究發現，歐洲人體內miR-137 與精神分裂癥之間的較強關聯性在中國漢族人群中被重復[10]。miR-137 與EFNB2 結合的序列是保守的[11]，通過計算預測分析和報告基因分析，EFNB2 基因被miR-137 直接靶向調控。包括EFNB2 在內的腎上腺素B 的激活可以彌補Reelin 的缺失，而Reelin 信號是神經系統正常運作所必需的，這種通路的中斷導致了異腦癥，這是一種與精神分裂癥相關的嚴重發育障礙[12]。既往研究表明，miR-137 調節成人神經發生、神經元成熟和突觸前可塑性，miR-137 的過度表達導致突觸小泡運輸受損和突觸可塑性改變[13]。Wu等[14]研究顯示，EFNB2 作為miR-137 的直接靶標，miR-137 是精神分裂癥的危險因素，可能與NMDA受體信號轉導和/或Reelin 信號通路有關。

圖2 miR-137 基因表達對精神分裂癥診斷價值的ROC 曲線分析

通過本研究結果可以看出，EFNB2 基因rs550067317 位點C 等位基因頻率顯著低于對照組，以A 等位基因為參考進行非條件Logistic 回歸模型估計結果顯示，C 等位基因是精神分裂癥發生的保護因素，說明攜帶A 等位基因的群體具有比C 等位基因攜帶者具有更高的精分裂癥風險。本研究結果還顯示，AA 基因型受試者血漿miR-137 水平顯著高于AC 基因型、AC 基因型顯著高于CC 基因型（P＜0.01）。根據Wu 等[14]研究結果發現，內源性EFNB2表達在蛋白質水平上可以被miR-137 下調，rs550067317 位點位于3’-UTR 與miR-137 的結合位點上，C 等位基因影響miR-137 與EFNB2 基因3’-UTR 的結合，進而影響miR-137 對EFNB2 表達的調控作用，具體表現為A 等位基因EFNB2 低表達，被miR137 抑制，C 等位基因EFNB2 高表達。

此外，在使用ROC 曲線分析miR-137 診斷精神分裂癥時發現，以EFNB2 基因rs550067317 位點所有基因型為對象，AUC 為0.8619，P＜0.0001，敏感度為72.94%，特異度為85.88%，cut-off 值為2.45。當僅考慮rs550067317 位點野生型（AA）受試者時，miR-137 診斷精神分裂癥的AUC 為0.9791，P＜0.0001，敏感度為98.53%，特異度為95.59%，cut-off 值為3.75。當僅考慮rs550067317 位點突變型（AC+CC）受試者時，miR-137 診斷精神分裂癥的AUC 為0.8529，P=0.0004，敏感度為76.47%，特異度為76.47%，cut-off值為2.25。由此結果可知，野生型型群體中miR-137診斷精神分裂癥的價值高于突變型。

本研究有以下不足之處。首先，沒有建立EFNB2表達模型驗證EFNB2 基因rs550067317 位點單核苷酸多態性與EFNB2 表達以及與血漿miR-137 水平的相關性；其次，樣本量較小，可能影響統計結果的準確性。

綜上所述，EFNB2 基因rs550067317 位點基因多態性與精神分裂癥風險相關，血漿miR-137 水平檢測精神分裂癥具有較高的診斷價值，其中野生型群體中診斷價值最高，敏感度高達98.53%，特異度高達95.59%。