藍莓鯊烯合酶基因的克隆與表達分析

陳新 徐麗 張力思 魏海蓉 宗曉娟 王甲威 譚鉞 朱東姿 洪坡 劉慶忠

摘要：鯊烯合酶基因（SQS）在植物三萜類化合物合成途徑中起著重要作用，是上游代謝通路中的關鍵基因。本研究采用RT-PCR技術從‘喜來藍莓根中克隆得到VcSQS基因，序列全長1489bp，序列分析結果表明，其含有1242bp的開放閱讀框，編碼413個氨基酸。氨基酸同源序列分析表明，藍莓與其它物種SQS蛋白氨基酸序列相似性很高，與山茶科的茶相似性最高，達90.58%，與葡萄相似性達87.92%。熒光定量試驗結果表明，SQS基因在藍莓葉中的表達量最高，芽中的最低。

關鍵詞：藍莓;角鯊烯合酶基因;同源序列分析;熒光定量

中圖分類號：S663.9文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）05-0001-06

我國藍莓的種植面積和產(chǎn)量逐年遞增，其鮮果多直接食用或加工成一些初級產(chǎn)品果汁、果醬等，缺乏對其高附加值產(chǎn)品的探索。研究表明，藍莓果實富含多種具有良好保健作用的功能活性物質(zhì)，果內(nèi)糖、酸、礦物元素、尼克酸、SOD、黃酮含量非常豐富[1];藍莓除含黃酮類物質(zhì)和多酚外，還含有三萜類物質(zhì)熊果酸和齊墩果酸[2]。

熊果酸（ursolicacid，UA），分子式為C30H48O3，分子量為456.68，是存在于植物中的五環(huán)三萜類化合物，具有一定的生物活性和重要的藥理作用[2-6]。已有研究證明熊果酸具有抗腫瘤、抗癌、保肝、消炎等多種功效，能夠抵抗多種致癌及促癌物。張秋萍等[7]認為熊果酸對人白血細胞K562的體外增殖有一定的抑制作用，其抑制效果與所用劑量成正比，并且能夠誘導K562細胞的凋亡。Kassi等[8]證明熊果酸可明顯抑制前列腺癌細胞PC-3和LNCaP。此外，熊果酸中含有脂羥基化學結構，抗氧化能力強，能夠清除自由基，具有美白護膚的功效，多用于化妝品添加物。由于其特殊的藥理作用，熊果酸被推崇為最具潛力的抗癌藥物之一。另有研究發(fā)現(xiàn)熊果酸對化學藥品引起的肝損傷擁有比齊敦果酸更好的療效[9]。因此，藍莓三萜類物質(zhì)的研究對于癌癥等疾病的治療具有深遠意義。

三萜類化學物質(zhì)的合成主要依賴的合成途徑是類異戊二烯代謝途徑[10]。鯊烯合酶分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，兩分子的法尼基焦磷酸在該酶的催化下，生成一分子的鯊烯[11]，而鯊烯是三萜類化合物的第一個前提物質(zhì)[12]。所以，對控制鯊烯合酶合成的基因SQS的研究顯得尤其重要，有助于我們在分子水平上利用基因工程的手段實現(xiàn)三萜皂苷的規(guī)模化生產(chǎn)。

大多數(shù)植物的SQS以基因家族的形式存在，其在不同物種中除成員數(shù)量不同，表達量也存在差異[13，14]。研究者在擬南芥中發(fā)現(xiàn)6種SQS基因異構型，能夠編碼1～3種有功能的鯊烯合酶，另外的4～6種沒有催化活性[15];在所有組織中SQS1異構型均有表達，而SQS2不同，主要在葉脈中表達[16]。人參有3個異構型的基因，都可催化角鯊烯的合成[10];北柴胡有2個SQS基因的氨基酸同源序列相似性達到96%[17]。由此可以看出，同一物種不同異構型的SQS基因所表達的蛋白質(zhì)氨基酸序列相對保守。現(xiàn)已克隆出多種植物的SQS基因，并在分子水平上對植物體內(nèi)的三萜類物質(zhì)的代謝做了深入研究。

本研究利用RT-PCR技術從藍莓中克隆到VcSQS基因，并與其它物種的SQS氨基酸序列進行同源對比，同時分析該基因在不同組織中的表達水平，以期探明鯊烯合酶在不同物種間的保守性及進化關系，并為進一步探究SQS基因表達與三萜皂苷類含量的關系奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料‘喜來藍莓根取自山東省果樹研究所泰東苗圃。取材后用液氮速凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2總RNA的提取及cDNA的合成

利用TaKaRaMiniBESTPlantRNA提取試劑盒提取藍莓根RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶的完整性。將提取后的RNA參照abmgood|5XAll-In-OneRTMasterMix反轉錄試劑盒說明書步驟進行反轉錄，將反轉錄得到的cDNA-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3VcSQS基因的克隆

根據(jù)已知其它植物SQS基因設計特異性引物（表1），以cDNA為模板，擴增目的片段VcSQS。PCR反應體系為20μL：模板0.5μL，上下游引物F、R各0.6μL，dNTP1.6μL，TaqDNAPoly-merase0.1μL，5×Buffer4μL，補水至終體積20μL。反應程序：94℃預變性3min;98℃變性10s，55℃退火5s，72℃延伸90s，35個循環(huán);72℃延伸5min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，拍照并記錄試驗結果。使用OMEGA公司的凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，將純化得到的目的片段連接到克隆載體pTOPO-Blunt上，轉化、篩菌后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，驗證全長序列的準確性。

1.4生物信息學分析

將序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行Blast比對分析，搜索并下載其它物種的序列。利用DNAMAN軟件進行不同物種間氨基酸序列同源性分析，利用MEGA7.0構建系統(tǒng)進化樹。

1.5VcSQS基因組織表達特性

所用VcSQS基因qRT-PCR的引物（表1）由通用生物公司合成。利用DBI公司的SYBRGREEN進行qRT-PCR。反應體系為20μL：模板為2μL，正反向引物各0.5μL，mix10μL，ddH2O7μL。利用ABI7500熒光定量儀采用兩步法進行熒光定量PCR擴增。反應程序：95℃120s，95℃10s，60℃30s，循環(huán)40次后進行熔解曲線分析。每樣品重復3次，采用2-ΔΔct的計算方法分析相對表達量。以藍莓青果的表達量為對照。

2結果與分析

2.1VcSQScDNA的克隆分析

對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示，擴增條帶大小為1500bp左右，與預期一致，可初步判斷得到VcSQS基因。使用凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，再次電泳，得到與PCR產(chǎn)物大小一致的條帶（圖2）。

2.2VcSQS基因的獲得及序列分析

利用RT-PCR和RACE技術從藍莓根中成功克隆VcSQS基因，序列全長為1489bp。其含有1242bp的開放閱讀框，共編碼413個氨基酸（圖3）。

2.3藍莓VcSQS的同源序列分析

利用DNAMAN軟件對推導的藍莓VcSQS氨基酸序列與其它物種進行同源性分析，結果（圖4）顯示，其與甘藍、薺藍、水稻、蓖麻的同源性在70%～80%之間;與甘藍的同源性最低，為70.79%;與另外10種植物的同源性都在80%以上，與茶的同源性達到90.58%。總體而言，藍莓與所參考的14種植物SQS蛋白的氨基酸序列相似性較高。

2.4藍莓VcSQS的系統(tǒng)進化分析

為了更加清晰地看出藍莓VcSQS與其它植物SQS之間的進化關系，利用MEGA7.0軟件，在多重比較的基礎上，將包括藍莓在內(nèi)的15種植物的SQS蛋白氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹（圖5）。藍莓SQS與山茶科植物茶為一個類群，親緣關系最近，與葡萄的親緣關系也較近;與其它種屬植物的親緣關系稍遠，這與氨基酸序列同源性結果一致。這表明SQS基因具有種屬特異性。

2.5藍莓VcSQS基因在不同組織相對表達量分析

本試驗分別提取藍莓的青果、紫果、花、葉、芽、根的總RNA，反轉錄得到cDNA，進行熒光定量分析。由圖6可以看出，藍莓不同組織中VcSQS基因相對表達量的高低依次為葉、青果、根、花、紫果、芽。

3討論與結論

三萜類化合物具有良好的藥用價值和經(jīng)濟價值，對其有關次生代謝產(chǎn)物合成的基因調(diào)控研究現(xiàn)已發(fā)展成為熱點領域。角鯊烯合酶SQS在三萜類化合物合成途徑中發(fā)揮重要作用，是上游代謝通路中的一個關鍵酶。目前，關于角鯊烯合酶的研究多集中于藥用植物人參、刺五加等，對藍莓的SQS研究較少。本研究以‘喜來藍莓品種為試材，從根中成功克隆VcSQS基因，序列分析表明，VcSQS基因含有1242bp的開放閱讀框，編碼413個氨基酸。氨基酸同源序列分析表明，藍莓與山茶科的茶相似性最高，達90.58%，與葡萄相似性達87.92%。系統(tǒng)進化樹表明藍莓SQS與山茶科植物茶親緣關系最近，為一個類群，與葡萄的親緣關系也較近，同源序列比對結果和系統(tǒng)進化樹得到的結論一致。熒光定量檢測結果表明，VcSQS基因在藍莓的果實、花、葉、芽、根組織器官中均有表達，葉中的表達量最高，芽中的表達量最低，青果中的表達量高于紫果。邢朝斌等[18]對刺五加角鯊烯合酶基因的研究表明SQS在葉片中的表達量要高于根。這與本研究中得出的葉中高于根中的結果一致。由此證明很有可能對于不同的物種來說葉中SQS基因表達量相對較高。但對于利用基因工程技術使SQS基因在指定組織中得到高效異源表達，進而提高三萜類物質(zhì)的合成，仍需進一步探究。

參考文獻：

[1]王二雷.藍莓花青素高純提取物的制備技術及誘導腫瘤細胞凋亡作用研究[D].長春：吉林大學，2014.

[2]LiuJ.Oleanolicacidandursolicacid：researchperspectives[J].JournalofEthnopharmacology，2005，100（1/2）：92-94.

[3]廖一帆.五環(huán)三萜皂苷的合成途徑及生物活性研究進展[J].湖北中醫(yī)學院學報，2010，12（3）：60-62.

[4]張園，張信文，陳光英.五環(huán)三萜類化合物抗腫瘤作用的研究進展[J].海南師范大學學報（自然科學版），2011，24（1）：92-95.

[5]FarinaC，PinzaM，PifferiG.Synthesisandanti-ulceractivityofnewderivativesofglycyrrhetic，oleanolicandursolicacids[J].Farmaco，1998，53（1）：22-32.

[6]LiuJ.Pharmacologyofoleanolicacidandursolicacid[J].JournalofEthnopharmacology，1995，49（2）：57-68.

[7]張秋萍，謝珞琨，鄧濤，等.熊果酸促進K562細胞凋亡[J].基礎醫(yī)學與臨床，2004，24（4）：414-417.

[8]KassiE，PapoutsiZ，PratsinisH.etal.Ursolicacid，anaturallyoccurringtriterpenoid，demonstratesanticanceractivityonhumanprostatecancercells[J].J.CancerRes.Clin.Oncol.，2007，133（7）：493-500.

[9]馬學惠，趙元昌，尹鐳，等.齊墩果酸防治實驗性肝損傷作用的研究[J].藥學學報，1982，17（2）：93-97.

[10]KimTD，HanJY，HuhGH，etal.ExpressionandfunctionalcharacterizationofthreesqualenesynthasegenesassociatedwithsaponinbiosynthesisinPanaxginseng[J].PlantCellPhysiol.，2011，52（1）：125-137.

[11]KimYS，ChoJH，ParkS，etal.GeneregulationpatternsintriterpenebiosyntheticpathwaydrivenbyoverexpressionofsqualenesynthaseandmethyljasmonateelicitationinBuplerumfalacatum[J].Planta，2011，233：343-355.

[12]HaralampidisK，TrojanowskaM，OsbournA.Biosynthesisoftriterpenoidsaponinsinplants[J].Planta，2011，233（2）：343-355.

[13]UchidaH，YamashitaH，KajikawaM，etal.Cloningandcharacterizationofasqualenesynthasegenefromapetroleumplant，EuphorbiatirucalliL.[J].Planta，2009，229（6）：1243-1252.

[14]吳耀生，朱華，李坤，等.三七鯊烯合酶基因在三七根、莖、蘆頭中的轉錄表達與三萜皂苷合成[J].中國生物化學與分子生物學報，2007，23（12）：1000-1005.

[15]RasberyJM，ShanH，LedairRJ，etal.Arabidosisthaliamasqualeneepoxidase1isessentialforrootandseeddevelopment[J].Biol.Chem.，2007，282（23）：17002-17013.

[16]BusquetsA，KeimV，ClosaM，etal.Arabidopsisthalianacontainsasinglegeneencodingsqualenesynthase[J].PlantMol.Biol.，2008，67（1/2）：25-36.

[17]隋春，魏建和，戰(zhàn)晴晴，等.北柴胡鯊烯合莓基因及其編碼區(qū)cDNA克隆與序列分析[J].園藝學報，2010，37（2）：283-290.

[18]邢朝斌，龍月紅，李非非，等.刺五加鯊烯合酶基因家族兩成員的表達及其與皂苷含量的關系[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2014，27（3）：1252-1255.