柴芍口服液中芍藥苷含量的高效液相色譜法測定

張會梅 孫亞磊 王艷玲 鐘英杰 魏秀麗 付海寧 欒明娜 龐云露 蔣貽海 徐恩民

摘要：采用高效液相法對柴芍口服液指標性成分芍藥苷含量進行測定。色譜柱：ZorbaxSBC18（4.6mm×250mm，5μm）;流動相：乙腈+0.05%磷酸溶液（14∶86）;流速：1.0mL/min;柱溫：35℃;檢測波長：230nm。經精密度、穩定性、重復性、回收率等驗證，在該色譜條件下能夠達到對柴芍口服液的質量控制。

關鍵詞：柴芍口服液;高效液相色譜;芍藥苷

中圖分類號：S815.4文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）05-0144-04

本研究中的新中獸藥柴芍口服液由柴胡、白芍、枳實、甘草4味中藥組方，經提取制備而成，具有透解郁熱、調和肝脾的功效，主治由霉菌毒素導致的雞肝損傷。柴胡的主要有效成分為五環三萜類柴胡皂苷a-f和揮發油，具有鎮靜、解熱鎮痛、抗炎和免疫調節等功能[1];白芍中含有豐富的單萜苷類化合物，以芍藥苷、芍藥內酯苷、羥基芍藥苷和氧芍藥苷等為主，具有多途徑抑制自身免疫反應，以及抗炎、止痛、保肝等多種藥理作用[2];枳實主要含有黃酮類、生物堿類、揮發油類等成分，具有調節腸胃運動、調節子宮功能、升壓、強心、抗氧化、抗菌、鎮痛、抗血栓等藥理作用[3];甘草的活性成分是三萜皂苷和黃酮類化合物，具有抗潰瘍、抗炎、解痙、抗氧化、抗病毒、抗癌、抗抑郁、保肝、祛痰和增強記憶力等多種藥理活性。芍藥苷為柴芍口服液中的重要有效成分。參照文獻[4]，本試驗采用高效液相色譜法對本品中芍藥苷含量進行檢測，并提供方法學研究資料。

1材料與方法

1.1藥品及對照品

柴芍口服液（批號：20180601），濰坊諾達藥業生產。

芍藥苷：中國食品藥品檢定研究院，純度96.4%，批號：110736-201438。

1.2儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀（G1311C四元泵，G1329B自動進樣儀，G1316A柱溫箱，G4212B二極管陣列檢測器，Agilent化學工作站）;Agilent1200高效液相色譜儀（G1322A脫氣機，G1311A四元泵，G1329A自動進樣儀，G1315D二極管陣列檢測器，Agilent化學工作站）。

AS20500B型超聲波清洗儀：天津AutoScienceCo.Ltd.;DHG-9101.2S型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海三發科學儀器公司;數顯恒溫水浴鍋DK-S2.4：上海三發科學儀器公司;BT125D型電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

試劑：甲醇（色譜純）：MercKKGaA;乙腈（色譜純）：美國Tedia天地試劑公司;磷酸為國產分析純。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：ZorbaxSBC18（4.6mm×250mm，5μm）;流動相：乙腈-0.05%磷酸溶液（14∶86）;流速：1.0mL/min;柱溫：35℃;檢測波長：230nm;進樣量10μL。液相色譜梯度洗脫見表1。

1.3.2樣品及對照品溶液的制備

對照品溶液的制備：精密稱取芍藥苷對照品適量，加14%乙腈制成80μg/mL的溶液，即得。

供試品溶液的制備：精密量取本品1mL，置50mL量瓶中，用14%乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2結果與分析

2.1系統適應性試驗

取試驗藥品（批號：20180601），按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按建立的色譜條件進樣分析6次，記錄色譜圖。結果（表2）：理論板數n>3000，芍藥苷與最鄰近峰的分離度R>1.5，試驗系統可靠有效。

2.2專屬性試驗

按照樣品的制備方法，制備缺失芍藥苷的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液，分別精密吸取陰性對照溶液與芍藥苷標準品溶液各10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果：陰性樣品的圖譜中（圖1），在與供試品圖譜中芍藥苷（圖2）的色譜峰位置上（Rt=12.756）無干擾，說明本方法測定芍藥苷專屬性良好。

2.3線性關系考察

精密稱定20.24mg芍藥苷，置50mL量瓶中，加入14%乙腈溶液，溶解后稀釋定容至刻度，得含芍藥苷401.76μg/mL的對照品貯備液。精密量取對照品貯備液適量，用14%乙腈稀釋，得分別含芍藥苷16.07、40.18、80.35、160.70、200.88、401.76μg/mL的系列對照品溶液。

按建立的色譜條件進行分析，記錄色譜圖與峰面積，結果見表3。以芍藥苷峰面積為縱坐標，芍藥苷的濃度（μg/mL）為橫坐標，進行線性回歸，得芍藥苷標準曲線（n=6）（圖3）?；貧w方程：y=12.465x+21.147，R2=0.9997。表明芍藥苷含量在16.07～401.76μg/mL范圍內線性關系良好。

2.4精密度試驗

按供試品溶液制備方法，制備批號20180601的供試品溶液。按建立的色譜條件重復進樣6次，記錄色譜圖，計算峰面積值，結果見表4。按芍藥苷峰面積計算RSD值等于0.87%（n=6），說明儀器的精密度良好。

2.5穩定性試驗

取同一批號樣品（批號：20180601），按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、12h進樣分析，記錄色譜圖，計算峰面積值，結果見表5。按芍藥苷峰面積計算RSD等于0.37%（n=6），說明樣品溶液在12h內穩定。

2.6重復性試驗

取同一批號樣品（批號：20180601），按供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，根據峰面積值計算芍藥苷含量，結果見表6。按芍藥苷含量計算RSD等于0.43%（n=6），說明方法重復性良好。

2.7回收率試驗

精密量取已知含量的同一批號樣品（批號：20180601）0.5mL共6份，分別置于50mL的容量瓶中，分別加入25mL芍藥苷對照品儲備溶液（90.89μg/mL），加入14%乙腈定容至刻度，按供試品溶液制備方法制備供試品，經0.45μm微孔濾膜濾過后，吸取10μL進樣，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算。結果見表7：芍藥苷的平均回收率為101.81%，RSD為0.73%（n=6）。

2.8耐用性試驗

取同一批號樣品（批號：20180601），按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別考察流動相比例變化（±2%）、柱溫變化（±5℃）、流速相對值變化（±20%）、同一類型不同廠牌色譜柱對樣品色譜行為的影響，記錄色譜圖。觀察芍藥苷峰和臨近峰的基線分離情況，并計算各條件下芍藥苷含量的相對標準偏差。結果見表8：在各條件下，芍藥苷峰與臨近峰達到基線分離。并且在流動相比例、柱溫有小的變動、換用同一類型不同廠牌色譜柱時，均不影響含量測定結果。

3結論

柴芍口服液是由四逆散經過提取而制成的制劑。在含量測定部分，以柴芍口服液中的芍藥苷為指標成分，通過色譜條件的優化，建立了理論塔板數高、分離度好的色譜條件。經過精密度、穩定性、重復性考察及加樣回收率試驗等方法學驗證，該方法具有較高的準確性和重現性，能夠達到對新中獸藥柴芍口服液中芍藥苷的含量檢測要求。

參考文獻：

[1]謝東浩，蔡寶昌，安益強，等.柴胡皂苷類化學成分及藥理作用研究進展[J].南京中醫藥大學學報，2007，23（1）：63-65.

[2]高小榮，田庚元.白芍化學成分研究進展[J].中國新藥雜志，2006，15（6）：416-418.

[3]張紅，孫明江，王凌.枳實的化學成分及藥理作用研究進展[J].中藥材，2009，32（11）：1787-1790.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].2015版.北京：中國醫藥科技出版社，267，786.