抗病小黑麥異染色體系的創(chuàng)制與鑒定

張宴萍 亓斐 徐勤省 鮑印廣 王洪剛 李興鋒

摘要：黑麥屬作為小麥的三級(jí)基因源，具有抗多種病害及耐逆性強(qiáng)等特性，是小麥遺傳改良重要的近緣植物之一。本研究利用CIMMYT引進(jìn)的六倍體小黑麥20090148與普通小麥材料復(fù)合雜交，從雜交后代中篩選出了四份遺傳穩(wěn)定、綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的材料：127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1，對(duì)其抗病性等性狀特點(diǎn)進(jìn)行鑒定，并利用寡核苷酸探針套進(jìn)行染色體原位雜交鑒定，以明確其遺傳組成。結(jié)果表明127-12-2、134-5-1和125-3-1為小麥-黑麥漸滲系，131-2-3為代換系;通過(guò)將131-2-3與其親本進(jìn)行核型比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其染色體組成。四份小黑麥材料的性狀和遺傳組成鑒定，將為它們?cè)谛←溸z傳改良上的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小黑麥;農(nóng)藝性狀;抗病性;染色體原位雜交

中圖分類號(hào)：S512.403.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）05-0007-06

小麥（TriticumaestivumL.）作為我國(guó)三大糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)直接關(guān)系到國(guó)家的糧食安全。培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥新品種，對(duì)于我國(guó)小麥產(chǎn)量穩(wěn)定和糧食安全起著舉足輕重的作用。小麥育種水平的高低很大程度上取決于掌握種質(zhì)資源的數(shù)量、質(zhì)量及對(duì)其研究的深度和廣度[1]。但目前小麥品種遺傳改良過(guò)程中，由于較長(zhǎng)時(shí)期以來(lái)集中利用少數(shù)親本材料，導(dǎo)致育成小麥品種的遺傳多樣性降低，產(chǎn)量和適應(yīng)性難以突破[2];普通小麥中許多優(yōu)良抗性基因逐漸失去抗性，小麥種內(nèi)遺傳資源日趨匱乏，已成為限制小麥遺傳改良取得重大突破的重要瓶頸之一。

黑麥（Secalecereale，RR，2n=14）作為小麥的近緣物種，蘊(yùn)藏著豐富的白粉病、葉銹病、條銹病和稈銹病等抗性基因，是小麥改良的重要基因資源。將黑麥抗病基因?qū)氲叫←溨校梢栽鰪?qiáng)小麥抗性并改良小麥品質(zhì)，對(duì)實(shí)現(xiàn)小麥高產(chǎn)高抗具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。小黑麥?zhǔn)呛邴溣幸婊蜣D(zhuǎn)入小麥形成的典型雙二倍體，分為四倍體（AARR，2n=28）、六倍體（AABBRR，2n=42）、八倍體（AABBDDRR，2n=56）及十倍體（AABBDDRRRR，2n=70），在生產(chǎn)上利用最廣泛、價(jià)值最高的屬六倍體和八倍體小黑麥。六倍體小黑麥將小麥的早熟、品質(zhì)優(yōu)良與黑麥的耐逆境脅迫、抗病性強(qiáng)等特點(diǎn)結(jié)合在一起，是轉(zhuǎn)移黑麥優(yōu)良基因的橋梁材料。

利用黑麥基因資源改良小麥品種的最理想方式就是創(chuàng)制小麥-黑麥易位系。目前已報(bào)道了眾多的小麥-黑麥易位系，但只有1RS/1BL易位被成功利用。2012年，毛勇以高感條銹病的小麥品種綿陽(yáng)11（MY11）和免疫條銹病的白粒黑麥自交系后代雜交，檢測(cè)到雜交后代中產(chǎn)生了新的高抗條銹病的小麥-黑麥1RS/1BL易位系[3];同年，賈舉慶等將綿陽(yáng)11與波斯小麥-非洲黑麥雙二倍體雜交，在F6代篩選到大量新的易位系材料，并且其中有許多是漸滲系[4]。2013年，李宇新等利用小麥-黑麥二體代換系間雜交，發(fā)現(xiàn)可顯著提高易位系產(chǎn)生的頻率[5]。

外源遺傳物質(zhì)的有效轉(zhuǎn)移與利用在相當(dāng)大程度上依賴于對(duì)小麥背景中外源染色體或染色體片段的準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便追蹤及鑒定。本研究應(yīng)用寡核苷酸探針套，對(duì)綜合農(nóng)藝性狀較好的小黑麥-普通小麥雜交后代127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1進(jìn)行熒光原位雜交（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）與基因組原位雜交（genomicinsituhybridization）技術(shù)結(jié)合的鑒定，可以同時(shí)區(qū)分黑麥1R～7R染色體并構(gòu)建小麥染色體和外源黑麥染色體的核型，極大地提高遺傳材料的鑒定效率。

1材料與方法

1.1供試材料

供試材料為從CIMMYT引進(jìn)的六倍體小黑麥20090148與多個(gè)普通小麥材料復(fù)合雜交得到的多份后代種質(zhì)材料。對(duì)其中綜合農(nóng)藝性狀較好且穩(wěn)定遺傳的四份種質(zhì)材料127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1進(jìn)行綜合分析和鑒定。所用普通小麥親本包括萊州137、濟(jì)麥22（JM22）、SN224及SN4076-1等。以輝縣紅作為感病對(duì)照。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1農(nóng)藝性狀調(diào)查參照李立會(huì)等的《小麥種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[6]，對(duì)株高、穗長(zhǎng)、芒、株型和穗型等主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查。

1.2.2抗病性鑒定（1）苗期白粉病抗性鑒定：在培養(yǎng)箱內(nèi)接種白粉病E09菌種，設(shè)置培養(yǎng)箱相對(duì)濕度為60%，光照強(qiáng)度為60%，光周期為光照14h、黑暗10h，對(duì)應(yīng)溫度為20℃和18℃。在苗盤內(nèi)以感病對(duì)照輝縣紅種植感染行，待第一片葉充分展開(kāi)時(shí)，將白粉菌孢子接種到供試材料上，接種10～15d后，當(dāng)輝縣紅充分發(fā)病時(shí)，參照盛寶欽（1988）[7]提出的0～4六級(jí)反應(yīng)型分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查抗病性，其中，0型指免疫;0;型指有壞死反應(yīng)，葉片有枯死斑;1型指高抗;2型指中抗;3型指中感;4型指高感。

（2）成株期白粉病鑒定：在大田進(jìn)行成株期白粉病抗性鑒定，種植輝縣紅作為感染行，待輝縣紅充分發(fā)病后，采集病菌抖撒在供試材料葉片上，同時(shí)借助感染行誘發(fā)感染，按照0～4六級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查抗病性。

（3）成株期條銹病鑒定：參照NY/T1443.1—2007《小麥抗病蟲(chóng)性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》第1部分《小麥抗條銹病評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》，在小麥拔節(jié)期進(jìn)行人工注射接種條銹混合病菌（條中32和條中33），以輝縣紅作為感病對(duì)照并種植感染行。待輝縣紅充分發(fā)病后，按反應(yīng)型0～4六級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查抗病性。

（4）成株期葉銹病鑒定：供試材料成株期葉銹病的鑒定參照《小麥抗病蟲(chóng)性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》第2部分《小麥抗葉銹病評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》，以輝縣紅作為感病對(duì)照并種植感染行，待輝縣紅充分發(fā)病后，按反應(yīng)型0～4六級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查抗病性。

1.2.3熒光原位雜交首先參照Dolezel等[8，9]的方法，稍作改動(dòng)，獲得根尖有絲分裂中期染色體制片;然后利用略微調(diào)整的寡核苷酸探針套[10]進(jìn)行原位雜交，在同時(shí)進(jìn)行寡核苷酸探針套FISH和GISH時(shí)，將pSc119.2-1的修飾改為TAMRA，以便與綠色基因組探針區(qū)別。并參考Zhuang等[11]描述的FISH程序，在雜交液中額外加入黑麥基因組DNA探針2.5μL和YN15基因組DNA1.7μL作為封阻。原位雜交時(shí)，在105℃加熱1min，取出后迅速置于-20℃冰乙醇10min以上;期間將制片置于70%乙醇+NaOH中，24℃變性6min，迅速依次置于70%、95%、100%乙醇，各脫水3min，用吸耳球吹干;雜交液和片子均變性完成后，將雜交液滴到蓋玻片的分裂相上，于37℃恒溫箱雜交6h以上，復(fù)染并鏡檢。

2結(jié)果與分析

2.1農(nóng)藝性狀調(diào)查及抗病性鑒定

在六倍體小黑麥20090148與多個(gè)普通小麥材料復(fù)合雜交后代中，篩選到綜合表現(xiàn)較好的四份材料：127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1，對(duì)其進(jìn)行田間成株期農(nóng)藝性狀調(diào)查。四份材料平均株高最高的為134-5-1，最低的為127-12-2，株型均為中間型，且有芒，穗型分為長(zhǎng)方穗、棍棒穗和圓錐穗三種類型，除134-5-1外均抗倒伏（圖1和表1）。

間白粉病、田間條銹病及田間葉銹病均表現(xiàn)免疫、高抗或中抗，可以作為抗病材料選育的種質(zhì)資源。

2.2細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果

本研究利用改進(jìn)的染色體原位雜交技術(shù)，通過(guò)一次細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)獲得GISH與FISH兩次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，不僅極大地優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)效率，而且可以明確所鑒定材料中外源黑麥染色體的具體同源群、核型以及普通小麥的染色體核型。

結(jié)果（圖3）顯示，四份小黑麥種質(zhì)系材料的染色體數(shù)目均為2n=42條，其中127-12-2、134-5-1和125-3-1中未檢測(cè)到較大片段外源染色體，推測(cè)為小麥-黑麥漸滲系材料;131-2-3雖然染色體為42條，但是出現(xiàn)2D染色體被2R染色體取代的現(xiàn)象，為2D/2R代換系。

在細(xì)胞學(xué)結(jié)果獲得的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1的核型，見(jiàn)圖4。對(duì)種質(zhì)系131-2-3的小黑麥親本20090148、普通小麥親本SN224和濟(jì)麥22也分別進(jìn)行了原位雜交鑒定，構(gòu)建染色體核型，并將三個(gè)親本材料的染色體與131-2-3的染色體進(jìn)行核型比對(duì)，結(jié)果（圖5）顯示，除2R代換了普通小麥的2D染色體外，131-2-3中的6A、1B和2B染色體與三個(gè)親本染色體上的信號(hào)位點(diǎn)均出現(xiàn)了差異，表明131-2-3染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變異。

3討論與結(jié)論

小黑麥異染色體系的創(chuàng)制是黑麥中優(yōu)異基因向普通小麥轉(zhuǎn)移的主要途徑，它的創(chuàng)制為優(yōu)良種質(zhì)材料的選育及進(jìn)一步明確抗病來(lái)源及基因定位創(chuàng)造了條件。作為重要的白粉病抗源，小黑麥異染色體系已經(jīng)被發(fā)掘出多個(gè)白粉病抗性基因。例如：最早在小麥-黑麥易位系品種Transec中發(fā)現(xiàn)的Pm7基因，來(lái)自黑麥Rosen;攜帶位于1RS上的Pm8基因的易位系被廣泛種植;利用X射線處理得到的1AL/1RS易位系A(chǔ)migo，含有位于1RS上的Pm17基因以及最早在6BS/6RL易位系MIP6中發(fā)現(xiàn)的Pm20基因[12]。

同時(shí)，對(duì)于黑麥條銹病抗性基因的挖掘也是從選育小黑麥異染色體系開(kāi)始的。已正式命名的小麥條銹病抗性基因中，Yr9基因[13]源于德國(guó)黑麥Petkus，此外，2010年趙毓將小麥-奧地利黑麥雙二倍體與阿勃6B缺體系雜交，篩選出了對(duì)白粉病和條銹病皆免疫的6R/6A代換系[14];2011年，張懷瓊等選育了高抗條銹病的小麥-黑麥6B/6R易位系，確定條銹病抗性來(lái)自6R易位片段[15];2013年，雷孟平在小麥-非洲黑麥雙二倍體與小麥雜交后代中篩選出免疫條銹病的6R/6D代換系[16]，綜合以上材料選育的結(jié)果，可以說(shuō)明6R染色體上可能攜帶新的條銹病抗性基因。

此外，葉銹病抗性基因Lr45是在一個(gè)日本小麥-黑麥T2AS-2RS·2RL易位系中被發(fā)現(xiàn)的，來(lái)自黑麥Petkus，位于2RS上，是我國(guó)小麥葉銹菌的有效抗性基因，尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)Lr45基因有毒性的葉銹菌株，在小麥育種中具有很大的應(yīng)用潛力。

通過(guò)染色體工程和基因工程等方法對(duì)小黑麥異染色體系進(jìn)行改良選育優(yōu)良材料并研究黑麥染色體抗性基因，對(duì)于拓寬小麥的基因資源，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥品種起著至關(guān)重要的作用。本研究通過(guò)表型鑒定及細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的手段，獲得了127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1四份優(yōu)異小黑麥異染色體系材料，可用于進(jìn)一步創(chuàng)制優(yōu)良育種材料。

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