嗜鐵細菌地衣芽孢桿菌CAS20對柿樹的防病促生作用

余賢美 侯長明 張坤鵬 翟浩 王潔 馬亞男 安淼 艾呈祥

摘要：通過盆栽試驗和離體葉片接種試驗，研究嗜鐵細菌地衣芽孢桿菌CAS20對柿樹的防病促生作用。經浸種和灌根處理，CAS20可使柿樹幼苗分別增高76.72%和50.00%;在對峙平板中產生的抑菌帶寬為0.57cm;對柿樹炭疽病菌菌絲生長和孢子萌發抑制率分別為92.94%和83.91%。離體葉片接種試驗結果顯示，先接種CAS20菌懸液再接種菌餅和先接種菌餅再接種CAS20菌懸液，對柿樹炭疽病的離體防效分別為77.01%和69.35%，說明CAS20可能通過產生誘導系統抗性提高對柿樹炭疽病的防治效果。本研究結果表明，CAS20在防病促生方面具有良好的應用潛能。

關鍵詞：嗜鐵細菌;地衣芽孢桿菌;促生作用;柿樹炭疽病;防治效果

中圖分類號：S432.4+4文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）05-0120-05

地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）是一種革蘭氏陽性細菌，屬于常見的芽孢桿菌屬，可通過產生生物活化酶促進植物生長、增加產量[1]，對黃瓜枯萎病[2]和桃枝枯病[3]有良好的生防效果，對桃褐腐病菌[4，5]、黃瓜疫霉病菌[6]、番茄葉霉病菌[7]等病原真菌有較強的抑制活性，在促進植物生長和防治植物病害領域有非常突出的應用價值[1，8-10]。

柿樹炭疽病是危害柿樹的一種毀滅性病害，發生嚴重時可導致植株死亡，常造成重大經濟損失，已成為阻礙柿產業發展的重要因素[11-13]。通過研究嗜鐵細菌地衣芽孢桿菌CAS20對柿樹幼苗生長、柿樹炭疽病菌菌絲生長和孢子萌發的影響，明確了CAS20菌株的防病促生作用，以期為柿樹炭疽病的防治提供新的思路和途徑。

1材料與方法

1.1供試菌株

嗜鐵細菌地衣芽孢桿菌CAS20和柿樹炭疽病菌（Colleltrichumhorii），均由本課題組分離保存。

1.2CAS20的防病促生作用

1.2.1菌懸液的制備將CAS20接種到LB液體培養基中，于37℃、150r/min條件下振蕩培養過夜后稀釋1000倍繼續振蕩培養2h，10000r/min離心5min，去上清，用10mmol/L的無菌硫酸鎂溶液制成1×1010cfu/mL的菌懸液。

1.2.2生長促進作用設置2個處理：（1）CAS20菌懸液稀釋10倍（終濃度為1×109cfu/mL）用于浸泡柿種子48h;（2）以清水浸泡柿種子，待柿子幼苗移栽到盆缽后，按菌懸液與土壤1∶9的比例進行灌根接種，使接種后土壤中的菌體數約為1×109cfu/g，以清水浸泡柿種子和澆灌為對照，每處理10棵幼苗，重復3次。不定期澆水，以滿足幼苗生長的需要，2個月后測定柿樹幼苗的株高，按照以下公式計算CAS20的生長促進作用。

幼苗增高百分率（%）=（處理幼苗株高-對照幼苗株高）/對照幼苗株高×100

1.2.3拮抗試驗通過平板對峙法，在平板中央接種直徑為0.5cm的柿樹炭疽病菌菌塊，四周對稱接種CAS20，28℃條件下培養7d，測量抑菌帶寬并求其平均值。

1.2.4對菌絲生長和孢子萌發的影響采用菌絲生長速率法和孢子萌發法，分別測定CAS20對柿樹炭疽病菌菌絲生長和分生孢子萌發的影響。

菌絲抑制試驗：在無菌條件下，取100μL（1×109cfu/mL）CAS20菌懸液，用三角玻璃棒均勻涂抹在PDA培養基平板上，待菌液吸干后，將直徑0.5cm的柿樹炭疽病菌菌餅接種于培養基平板中央，以不涂抹菌懸液為對照，重復3次。接種后28℃恒溫倒置培養5d，用十字交叉法測量菌落直徑并求平均值，根據以下公式計算CAS20對柿樹炭疽病菌菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100

孢子萌發試驗：取10μL（1×1010cfu/mL）CAS20菌懸液和90μL（每毫升1×106個孢子）柿樹炭疽病菌孢子懸浮液，混勻后滴于潔凈的單凹載玻片上，25℃恒溫培養，以無菌水為對照。培養8h后，在顯微鏡下觀察分生孢子萌發情況，根據以下公式計算CAS20對柿樹炭疽病菌孢子萌發的抑制率。

孢子萌發抑制率（%）=（對照孢子萌發率-處理孢子萌發率）/對照孢子萌發率×100

1.2.5離體葉片接種試驗采集無機械傷、無病蟲害的健康柿樹嫩葉，以無菌大頭針刺傷葉片，設置以下2種接種方式：（1）噴霧接種CAS20菌懸液，2d后將柿樹炭疽病菌菌餅接種于傷口處;（2）將柿樹炭疽病菌菌餅接種于傷口處，2d后噴霧接種CAS20菌懸液。每個處理接種30片葉子，以接種菌餅+噴施無菌硫酸鎂溶液為對照，重復3次。28℃保濕培養，第7d統計發病情況。參照鄧維萍等[14]的方法測定病斑面積S，具體分級標準為：0級（-），不發病;1級（+），S≤1cm2;2級（++），1cm24cm2，統計各處理不同病級的葉片數，按照以下公式計算發病率降低百分率、病情指數及防治效果。

發病率降低百分率（%）=（對照發病率-處理發病率）/對照發病率×100

病情指數=Σ（各級病葉數×相應病級）/（葉片總數×最高病級）×100

防治效果（%）=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100

2結果與分析

2.1CAS20的生長促進作用

浸種處理和灌根處理均極顯著增加了柿樹幼苗的株高（圖1），柿樹株高分別增加了8.9cm和5.8cm，增高百分率為76.72%和50.00%;浸種處理和灌根處理的柿樹幼苗株高達到極顯著差異（P<0.01）（表1）。說明越早使用菌液處理，CAS20對植物的生長促進作用越大。

2.2CAS20對柿樹炭疽病菌的拮抗作用

接種柿樹炭疽病菌菌餅和CAS20菌株后，28℃條件下培養7d，在對峙平板上產生了明顯的抑菌帶（圖2），抑菌帶寬為（0.57±0.05）cm，說明CAS20對柿樹炭疽病菌具有較強的拮抗作用。

2.3CAS20對柿樹炭疽病菌菌絲生長和孢子萌發的抑制作用

CAS20對柿樹炭疽病菌的菌絲生長和孢子萌發具有較強的抑制作用，菌絲生長抑制率和孢子萌發抑制率分別為92.94%和83.91%（表2）。

2.4CAS20對柿樹炭疽病菌的離體防效

CAS20極顯著降低了柿樹炭疽病的發病率和病情指數，達到了良好的防治效果。其中，先接種CAS20菌懸液再接種柿樹炭疽病菌菌餅的發病率顯著低于先接種柿樹炭疽病菌菌餅再接種CAS20菌懸液，二者分別降低了54.76%和46.42%，防治效果分別為77.01%和69.35%，差異顯著（P<0.05）（表3），說明該菌株有可能通過產生誘導系統抗性，提高對柿樹炭疽病的防治效果。

3討論與結論

地衣芽孢桿菌由于具有防治植物病害、促進作物生長和提高作物產量的作用[1，8-10]，越來越多地受到關注。含地衣芽孢桿菌生物活化酶的磷肥，施用后在土壤中能達到分解磷的效果，可為作物前期提供有效磷，促進苗期快速生長，還可滿足中后期對有效磷的需要，使養分供應與作物生長同步，同時還可固氮、解鉀、改良土壤結構，提高化學利用率，從而大幅度增加大豆株高（4.6cm），顯著提高大豆產量（單株莢數平均增加2.5個，百粒重平均增加2g左右）[1]。本試驗發現，經浸種和灌根處理，CAS20極顯著增加了柿樹幼苗株高，浸種處理對幼苗株高的增加作用更為顯著，說明早期使用菌液處理可加強菌株對植物的生長促進作用。

王春曉等[7]發現，未離心的地衣芽孢桿菌NJWGYH833051發酵液可以有效抑制番茄葉霉病菌，當劑量為106cfu/mL時對番茄葉霉病菌的菌絲生長抑制率達87.15%，略低于多菌靈藥劑的抑菌效果。地衣芽孢桿菌W10菌液及其抗菌蛋白能明顯抑制桃褐腐病菌和桃枝枯病菌的菌絲生長、孢子萌發和芽管伸長，對貯藏期桃褐腐病有較好的抑制作用，能明顯推遲桃果發病時間，降低貯藏期自然腐爛率，抑制病斑擴展[3-5]。

本試驗中，CAS20對柿樹炭疽病菌具有較強的拮抗作用，在對峙平板中產生的抑菌帶寬為0.57cm，對菌絲生長和孢子萌發的抑制率分別為92.94%和83.91%。離體葉片接種試驗結果顯示，CAS20菌懸液顯著降低了柿樹炭疽病的發病率，先接種CAS20菌懸液后接種柿樹炭疽病菌菌餅和先接種柿樹炭疽病菌菌餅后接種CAS20菌懸液的防治效果分別為77.01%和69.35%，差異達到顯著水平，說明CAS20有可能通過產生誘導系統抗性[15]，提高對柿樹炭疽病的防治效果。

紀兆林等[4]研究發現，地衣芽孢桿菌W10（1×109cfu/mL）菌液對桃褐腐病菌的孢子萌發抑制率達100%，稀釋5倍的無菌濾液對菌絲生長抑制率為85.2%，稀釋2倍的無菌濾液產孢抑制率為84.0%;高汝佳[3]研究結果表明，2×109cfu/mL的W10菌液對桃枝枯病菌的生長抑制率為100%，1×109cfu/mL菌液完全抑制了病菌孢子萌發，而5×108cfu/mL菌液對孢子萌發的抑制率也高達80%以上。本試驗在同等菌液濃度（1×109cfu/mL）條件下，CAS20對柿樹炭疽病菌菌絲生長和孢子萌發抑制率略低于高汝佳[3]和紀兆林等[4]的結果，但均高于80%，說明CAS20對柿樹炭疽病菌亦具有較強的拮抗作用，但因病原菌不同，其抑制率略有差異。另外，CAS20對病菌菌絲生長和孢子萌發的抑制率低于33.5%喹啉銅懸浮劑、25%溴菌腈乳油、70%代森錳鋅可濕性粉劑、70%代森聯水分散粒劑、400g/L氟硅唑乳油和50%福美雙可濕性粉劑等[16]，與王春曉等[7]的結果一致。但從對土壤生態環境的影響及長遠考慮，生防菌株的應用比化學農藥更具有優勢，也更利于農業生產的可持續健康發展。

本試驗結果表明，CAS20在防治植物病害和促進植物生長方面具有良好的應用潛能。對于該菌株在田間對柿樹生長促進作用和對柿樹炭疽病等病害的防治效果有待進一步研究。

參考文獻：

[1]覃建忠，鄧正春，周詩彪，等.大豆施用含地衣芽孢桿菌生物活化酶磷肥試驗[J].作物研究，2017，31（7）：722-723.

[2]逯昀，常虹，閆振領.70億個/毫升地衣芽孢桿菌水劑對設施黃瓜枯萎病防治效果研究[J].商丘職業技術學院學報，2016，15（2）：115-116.

[3]高汝佳.桃枝枯病生物防治研究[D].揚州：揚州大學，2016.

[4]紀兆林，賀惠文，韓峰，等.地衣芽孢桿菌W10對桃褐腐病菌的抑制作用[J].揚州大學學報（農業與生命科學版），2015，36（3）：83-89.

[5]紀兆林，賀惠文，周慧娟，等.地衣芽孢桿菌W10及其抗菌蛋白對桃褐腐病的抑制作用[J].園藝學報，2015，42（10）：1879-1888.

[6]孫莉，易圖永，粟智平，等.黃瓜疫霉菌生防菌的篩選及鑒定[J].中國蔬菜，2015（6）：23-27.

[7]王春曉，胡永紅，楊文革，等.地衣芽孢桿菌NJWGYH833051的抑菌作用[J].湖北農業科學，2016，55（4）：904-907.

[8]EL-SheshtawyHS，AiadI，OsmanME，etal.ProductionofbiosurfactantfromBacilluslicheniformisformicrobialenhancedoilrecoveryandinhibitionthegrowthofsulfatereducingbacteria[J].EgyptianJournalofPetroleum，2015，24（2）：155-162.

[9]GobiN，MalaikozhundanB，SekarV，etal.GFPtaggedVibrioparahaemolyticusDahv2infectionandtheprotectiveeffectsoftheprobioticBacilluslicheniformisDahb1onthegrowth，immuneandantioxidantresponsesinPangasiushypophthalmus[J].Fish&ShellfishImmunology，2016，52：230-238.

[10]ShanthiS，JayaseelanBD，VelusamyP，etal.BiosynthesisofsilvernanoparticlesusingaprobioticBacilluslicheniformisDahb1andtheirantibiofilmactivityandtoxicityeffectsinCeriodaphniacornuta[J].MicrobialPathogenesis，2016，93：70-77.

[11]張敬澤，徐同，何黎平.浙江無核柿炭疽病病菌鑒定及附著胞形成過程中的核相變化[J].菌物學報，2005，24（3）：446-456.

[12]ZhangJZ.AnthracnoseofpersimmoncausedbyColletotrichumgloeosporioidesinChina[J].AsianandAustralasianJournalofPlantScienceandBiotechnology，2008，2（2）：50-54.

[13]DuSN，BaiGS，ZhangSJ，etal.Identificationandcontrolofpersimmonanthracnose[J].PlantDiseasesandPests，2010，1（1）：40-42.

[14]鄧維萍，楊敏，杜飛，等.云南葡萄產區葡萄炭疽病病原鑒定及致病力分析[J].植物保護學報，2013，40（1）：61-67.

[15]令利軍，馮蕾，雷蕾，等.地衣芽孢桿菌TG116誘導黃瓜抗病性相關防御酶系的研究[J].西北師范大學學報（自然科學版），2016，52（1）：100-104.

[16]余賢美，王潔，侯長明，等.16種殺菌劑對柿樹炭疽病菌哈銳炭疽菌的抑制效果[J].山東農業科學，2018，50（3）：90-93.