山東省濟寧青山羊群體遺傳多樣性分析

王可 劉昭華 曹洪防 楚惠民 崔緒奎

摘要：為了解近年來山東省對濟寧青山羊品種資源保護效果，采用微衛星DNA標記技術，對山東省境內的4個濟寧青山羊群體進行了遺傳多樣性和遺傳分化分析。結果顯示：24個微衛星位點在4個群體135個個體中共檢測到159個等位基因，平均每個位點6.6個;4個群體的PIC在0.6016～0.6653之間，群體的He在0.6750～0.7559之間，但是群體的Ho均低于He，LWQ最低（0.5375），JXQ最高（0.6260）;群體分化系數（Fst）為0.0774，基因流（Nm）分析表明每世代4個群體間有效遷移個體數為1.8905;遺傳距離和遺傳相似性指數分析表明，SXQ、HHQ和JXQ群體間具有較近的親緣關系，而與LWQ群體間遺傳距離相對較遠。結果表明：濟寧青山羊群體遺傳多樣性豐富，群體間存在一定的基因交流，遺傳分化水平較低，但4個群體都存在不同程度的近交，SXQ和LWQ群體的近交程度較高，所以在實際工作中，應注意擴大群體數量，避免近交衰退。

關鍵詞：濟寧青山羊;微衛星;資源保護;遺傳多樣性;遺傳分化

中圖分類號：S813.9文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）05-0129-06

濟寧青山羊（Jininggreygoat）是山東省優良的地方山羊品種，具有性成熟早、多胎多羔、常年發情、抗病力強、肉質鮮美等優良種質特性[1]，2006年被列為國家級畜禽遺傳資源保護品種[2]。近年來，隨著人們對羊肉需求量的日益增加，養羊效益和保種矛盾逐步凸顯，濟寧青山羊雜交濫交現象和品種資源消耗嚴重，純種數量不斷減少，優良種羊流失，品種資源保護形勢嚴峻[3]。這一問題引起相關政府部門足夠的重視，對濟寧青山羊的育種與改良開展了大量工作，使得濟寧青山羊養殖業步入良性發展軌道。經過系統的選種選配、提純復壯、核心群選育和加強飼養管理，濟寧青山羊種群數量、羊群整體質量得到顯著提高。為了進一步摸清濟寧青山羊品種資源最新動態及其遺傳結構和起源分化，本研究應用微衛星DNA標記技術，對濟寧青山羊群體遺傳多樣性和群體間的遺傳分化進行分析。

濟寧青山羊是在當地生態環境條件下，經過數百年的選育形成的優良地方品種，一直保持著閉鎖的繁殖方式，沒有受外來品種的影響，是非常寶貴的資源。目前，對濟寧青山羊分子遺傳方面的研究甚少，且多集中于對其繁殖性能相關候選基因的多態性研究[4-6]等方面，而在其種群和遺傳多樣性方面的研究相對滯后。所以，對濟寧青山羊的種群進行深入研究，掌握其資源現狀和發展趨勢，對制定合理有效的保種策略，促進濟寧青山羊品種資源的保護、開發及利用具有深遠的意義。

1材料與方法

1.1樣本采集

試驗樣本分別采自山東省4個濟寧青山羊種群血樣或小塊耳組織，共計135份（表1），個體之間無親緣關系，品種的外貌特征明顯。

1.2DNA提取

采用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒或常規酚氯仿抽提法提取基因組DNA，-20℃保存備用。

1.3試劑與儀器

試劑：血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司;PCRMix、DNAMarker等，購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

儀器：Eppendorf高速臺式離心機、EppendorfPCR擴增儀、電熱恒溫水槽、BIO-RAD凝膠成像儀及電泳系統、ABI3100-Avant全自動基因序列分析儀。

1.4微衛星引物

參照聯合國糧農組織（FAO）及國際遺傳學會（ISAG）的推薦，共篩選出24對熒光標記微衛星引物（表2）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5PCR擴增

PCR反應體系：PCRMix6.25μL，上下游引物（10mmol/L）各1μL，模板DNA1μL，補水至12.5μL。PCR反應條件：94℃5min;94℃30s，54、55、58℃或65℃30s，72℃30s，30個循環;72℃5min。

1.6微衛星DNA多態性分析

PCR產物、去離子甲酰胺、TAMRA（FAM或HEX）以0.5μL∶10μL∶0.5μL的比例混合，95℃變性5min，采用ABI3100-Avant全自動基因序列分析儀進行分析，用3100DataCollection軟件分析微衛星基因型。

1.7數據分析

用POPGEN1.32計算有效等位基因數（Ne）、雜合度及基因流等。多態信息含量（PIC）用PIC分析軟件計算。

2結果與分析

2.1微衛星DNA多態性分析

利用ABI3100-Avant全自動基因序列分析儀對135個樣本的PCR擴增產物進行分型測定，部分結果見圖1和圖2。24個微衛星位點的電泳圖峰形典型，易于判型，適于后續分析。

2.2群體內遺傳變異分析

微衛星位點上的觀察等位基因數（Na）和有效等位基因數（Ne）能夠反映群體內的變異程度，4個群體24個微衛星位點的PCR產物共檢測到159個等位基因，平均每個位點為6.6個，各位點有效等位基因數范圍為1.3423～6.4800，平均有效等位基因數3.5282（表3），說明選擇的微衛星標記在4個群體中具有多態性，適宜群體間遺傳關系的分析。

由表4可知，濟寧青山羊具有豐富的遺傳多樣性。4個群體的PIC在0.6016～0.6653之間，各群體He也較高（0.6750～0.7559），但是群體的Ho均低于He，LWQ最低為0.5375，JXQ最高為0.6260。

2.3群體間遺傳關系分析

從整個濟寧青山羊種群來看，群體內近交系數（Fis）為0.1099，其中有5個位點的Fis為負值，總群體近交系數（Fit）為0.2138，其中CSRD247基因座的Fit為負值，說明群體存在一定程度的近交，但群體內雜合體較多，近交程度尚不嚴重。群體間基因分化系數（Fst）為0.0774，說明7.741%的遺傳變異是由群體間差異引起的，而92.259%的遺傳變異是由各群體內個體間的差異引起的，群體間的遺傳分化水平較低。基因流（Nm）分析表明，每世代4個群體間有效遷移個體數為1.8905，說明群體間存在一定的基因交流（表5）。

2.4遺傳距離和遺傳相似性指數分析

由表6可知，SXQ、HHQ和JXQ群體間遺傳距離較近，遺傳相似性指數較高，表明3個群體間具有較近的親緣關系。而LWQ與3個群體間遺傳距離相對較遠，遺傳相似性指數相對較低，因此，群體間親緣關系相對較遠。

2.54個群體之間的聚類分析

由圖3可知，SXQ與HHQ群體的遺傳距離最小，親緣關系最近，首先聚在一起;然后兩者再與JXQ群體聚合，三者與LWQ群體的遺傳距離相對較遠。SXQ、HHQ和JXQ位于山東省的濟寧、菏澤地區，為濟寧青山羊主產區，而LWQ位于邊緣產區萊蕪，可見地理距離與遺傳距離具有較強的正相關性。

3討論與結論

Barker等[7]提出要滿足微衛星遺傳標記研究的需要，每個群體的樣本數量不能小于25。湯青萍等[8]認為，利用微衛星標記進行遺傳多樣性檢測時，選擇的引物應盡量均勻地分布于物種的各染色體上，引物數量應不低于20對，這樣結果才較準確。本研究采用的24個位點分布于9條染色體上，分析的個體數量、選用的微衛星標記數量都基本達到了遺傳多樣性檢測的要求，具有一定的可靠性。

本試驗檢測到的JXQ和HHQ的有效等位基因數略高于SXQ和LWQ的，其中以LWQ的有效等位基因數最低，表明各群體之間的遺傳結構存在差異，分析原因一方面可能是由于地理位置差異造成的，另一方面也可能與人工選擇有關。采樣的群體規模小、數量少，選育過程中存在的人為因素都可對群體的基因平衡產生影響[9]。4個群體的等位基因數均高于有效等位基因數，根據Hines等[10]的研究，這可能與近交有關，導致等位基因分布不均勻。

Botstein等[11]提出多態信息含量（PIC）是用來描述微衛星標記的變異程度和估計群體內的遺傳變異程度，當PIC>0.5時為高度多態標記，0.25

遺傳分化系數（Fst）可以反映群體近交或群體間遺傳分化程度[12]。本研究中Fst為0.0774，說明4個群體間的遺傳分化水平低，而且基因流大于1（1.8905），均質化作用強，能夠抵制遺傳漂變作用，防止群體間遺傳分化發生。結果表明濟寧青山羊已經在遺傳水平上形成了相對獨立的體系，依據不同地理位置形成了不同的生態類型。

總之，通過近年來加大對濟寧青山羊的保護力度，群體的遺傳多樣性得到了保留，群體間的基因流較大，遺傳分化水平較低。從保種效果來看，JXQ屬于國家級保種場，每年都得到政府的經費支持，遺傳基礎比較好，保留了濟寧青山羊最完整、最原始的優良基因，多態信息含量最高。LWQ位于邊緣產區，可能由于長期的地理隔離和生理隔離，群體數量不大，群體的同質性加大，遺傳多樣性丟失，平均雜合度降低。另外，從整個濟寧青山羊群體來看，都存在不同程度的近交，JXQ和HHQ的近交程度稍低于SXQ和LWQ，所以在實際保種工作中，應擴大群體數量，盡量避免近交，以維持濟寧青山羊群體的遺傳多樣性。

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