功能性釀酒微生物的篩選及其在綠色釀造生產中的應用

李 娜，程 偉，張 杰，潘天全，彭 兵

（安徽金種子酒業股份有限公司，安徽阜陽236023）

釀酒微生物通過一系列的生化作用，形成各種代謝產物，使原酒中的主體香、輔助香等風味物質相輔相成。由于釀酒微生物種類多、區系豐富等原因，目前，對白酒產香微生物的研究還不夠充分。應用現代分子生物學技術、微生物育種技術、微生物種群分析技術等，實現白酒釀造過程中功能性釀酒微生物的分離、培育與應用，進行種性分析、菌種改良等，揭示釀造微生物與白酒品評中“香、味、格”之間的聯系，尤其是功能性釀酒微生物與白酒中呈香呈味物質的相關性研究等，將在白酒現代化進程中起到重要作用，是今后白酒風味化學研究的重要方向與趨勢。根據功能性釀酒微生物的代謝特征及機制、產特征性風味物質微生物的代謝機理等，運用關鍵功能性釀酒微生物代謝及蛋白質代謝、糖代謝等代謝流，以期實現對關鍵功能性釀酒微生物及其特種功能性酶類的有效控制，具有重要的研究價值，進而起到調控白酒固態混合發酵體系代謝產物，豐富白酒中特征性風味物質，提升傳統發酵生產水平等作用。在綠色發展的過程中，白酒企業應該注重構建科技含量高、資源消耗低、環境污染少的產業結構和生產方式，全面推行綠色釀造。

1 白酒釀造技術或應用方面的主要研究方向

目前，白酒釀造技術或應用方面的主要研究方向如下：（1）固態發酵調控的機理及其規律研究；（2）固態發酵白酒特征性風味組分判斷方法及其與釀酒微生物的關聯性分析評價；（3）固態發酵白酒呈香呈味化合物形成機理、感官品評科學化方法、白酒特征圖譜分析等；（4）白酒釀造生產過程中多菌種微生物菌群的復雜性與風味化合物不穩定的關系；（5）大曲呈香、生香的未知性及制曲微生物毒素與釀造安全性評價等；（6）釀酒副產物的綜合利用技術研究。但行業的研究基本上都在圍繞白酒的口感風味這個主線，目的是滿足不同消費者口味需求，具體涉及功能性釀酒微生物及其在白酒釀造生產工藝技術革新等方面的研究急需加強。

隨著經濟的發展與科技的騰飛，人們在滿足物質層面的需求后開始追求健康、綠色、環保與可持續發展。20世紀80年代初，國家積極倡導創建綠色、園林式企業，白酒釀造企業也不例外。

生態釀酒被反復提起，并在廠區的建設、釀酒的工藝及副產物再利用方面得到長足的發展。具有代表性的是廣西貴港國家生態工業示范園區。該園區由蔗糖田、制糖、酒精、造紙、熱電聯產、環境綜合處理等6個系統組成。這6個系統相輔相成，通過副產物、廢棄物和能量的相互交換和銜接，形成了較為完整的閉合工業生態網絡[1]。

2007年9 月，中國釀酒工業協會牽頭依托江南大學和行業9家骨干企業進行的“169”項目啟動，是對行業的6項技術問題進行研究探索，取得了很大進展。但行業的研究基本上以圍繞白酒的口感風味為主線，目的是滿足不同消費者口味需求，具體涉及功能性釀酒微生物及其在白酒釀造生產工藝技術革新等方面的研究急需加強。綠色釀造啟動流程再造，推動信息化，扎實推進“綠色釀造、智能制造”。

2 功能性釀酒微生物的篩選及其應用研究進展

2.1 窖泥微生物

窖泥在釀酒生產中隨著窖齡的延長,營養成分的補充,酒醅發酵過程中溫度的變化等因素,使窖池中微生物的生態分布相對穩定；特別是一些厭氧菌,如己酸菌、丁酸菌、甲烷菌等得到馴化，逐步改善原酒的香味及其協調性。傳統老窖泥的形成，經過較長時間的泥糟相互浸潤，功能微生物菌群的遷移、演變、生長代謝等過程，形成了窖池特定微生物區系，并逐漸實現老窖池的微生態平衡體系、微生物的富集馴化、物質積累等。借助白酒窖泥老熟老化機理研究構建的白酒窖泥功能菌種資源庫及質量評估快檢技術平臺。運用現代生物工程技術繁育窖泥功能菌種并在窖泥改造中強化應用，將傳統窖泥制備工藝與復合營養、復合功能菌配合技術相結合，精心制作而成的窖泥老熟微生態制劑，可以有效地增加窖泥生化活力，實現增己降乳和提高優質酒產率。通過免培養分子生物學技術和指針菌數理模型的利用，可以快速檢測指針菌在窖泥中的存在狀況，及時指導窖泥老熟微生態制劑的利用，達到窖泥質量的有效維護和管控。

安大金種子產業技術研究院課題組從金種子優質老窖泥分離獲得的1株己酸菌（JZZ）作為生產菌種，菌株JZZ的菌落形態及其顯微特征見圖1。由圖1可知，菌株JZZ為革蘭氏陽性桿菌，頂端有芽孢，菌落呈白色圓形、扁平狀，表面光滑，四周有較為明顯的透明圈。經形態學和16SrDNA序列分析，窖泥己酸菌（JZZ）鑒定為克氏梭狀桿菌[2]Clostridium kluyveri，是新的產己酸的菌株。

2.2 大曲微生物

大曲是以大麥、小麥等為原料，在人為控制的一定溫度、濕度條件下，經過粉碎、加壓等步驟形成磚塊狀的曲坯[3]。大曲的制作是在一個完全開放式的環境中進行，在制作過程中大曲會富集眾多微生物，微生物的來源有空氣、原料、水等。由于環境、原料等因素對大曲制作的影響，使得大曲中的微生物情況十分復雜，大曲中微生物種類主要有霉菌、細菌以及酵母菌。不同溫度下，微生物種類各自的占比也不同，高溫曲中富含大量的細菌，其次是霉菌，而酵母菌在高溫下幾乎沒有。霉菌、細菌、酵母菌又被學者比喻為：霉菌——糖化動力，酵母菌——發酵動力，細菌——生香動力[4]。可見，這3種微生物在白酒釀造過程中具有十分重要的作用。金種子白酒釀造應用產蛋白酶嗜熱細菌制備的細菌麩曲，具有一定的液化力、糖化力及蛋白質水解力等，有利于原料中淀粉的糖化和蛋白質的分解，強化了美拉德反應。

圖1 金種子窖泥己酸菌菌株JZZ的菌落形態及其顯微特征

圖2 金種子大曲耐高溫產蛋白酶嗜熱細菌Nxzd4菌落形態及其顯微特征

圖3 金種子清香型酒醅產香酵母Jmx-01菌落及其顯微(40×)特征

如圖2所示，金種子大曲耐高溫產蛋白酶嗜熱細菌Nxzd4[5]的菌落呈乳白色，表面粗糙，大而扁平，邊緣不整齊，呈放射狀菌絲，透明性差，稍黏稠，易挑取；菌體多呈長桿狀，單個較多，芽孢可見，有少數兩連桿或三連桿鏈狀現象，屬芽孢桿菌。芽孢桿菌是醬香大曲中有益于醬香風味產生的功能微生物；從茅臺酒高溫大曲分離篩選得到的細菌中，選擇有代表性的7株芽孢桿菌制成三角瓶純種曲；純種成品曲與生產用曲粉的香氣比較接近，具有較強的醬香香氣。

2.3 酒醅微生物

酒醅微生物主要來自于酒曲、窖泥、地面、工具及設備等生產現場的環境中，其分布、消長和代謝情況對白酒的產量、品質、風味起著至關重要的作用[6]。酒醅的不同發酵周期、不同層面的微生物群落結構也不相同。不同香型白酒酒醅中的微生物種類及數量也不盡相同，清香型白酒酒醅較濃香型與醬香型而言，酒醅中微生物種類、數量較少，種群結構以細菌為主，霉菌與酵母菌次之。細菌類中主要有乳酸菌、醋酸菌、芽孢桿菌等；霉菌類中主要有根霉、毛霉、紅曲霉等；酵母菌類中主要有酵母菌屬、漢遜酵母和假絲酵母等。在固態白酒發酵過程中，酵母菌對產酒、產酯、生香等都有著重要的作用。

金種子酒業技術人員利用清香型發酵酒醅為篩選源，采用變色圈平板初篩，發酵力復篩，并結合乙酸乙酯生成能力測定、麩曲培養檢測、固態發酵產風味代謝物質分析等，篩選出高產乙酸乙酯酵母菌Jmx-01[7]。酵母菌Jmx-01的菌落及其美藍染色的鏡檢(40×)結果如圖3所示，其單菌落形態呈圓形、有隆起、乳白色、邊緣不整齊、易挑取、黏稠，長時間培養將呈暗黃色，具有酵母菌菌落的典型形態特征；其菌體呈長橢圓形，可見出芽繁殖形成的芽體。

2.4 釀酒環境微生物

釀酒環境微生物是影響白酒品質、風味的重要因素，釀酒環境是指在白酒釀造過程中直接或間接接觸的環境，它包含空氣、釀造使用的設備、工具、廠房地面等等。隨著技術的進步，人們對于白酒方面的研究也越加全面，對于釀酒環境微生物也有了更深入的探索，如唐玉明等[8]對曲房上中下不同位置空氣微生物進行分析，發現空氣中酵母菌和細菌與大曲中酸度呈顯著相關。曹達等[9]研究表明不同高度的醬香型釀酒車間空氣中的微生物含量及組成存在差異，這種差異會影響大曲質量。張良等[10]比較了瀘州老窖作坊內外空氣中細菌組成，認為芽孢桿菌是空氣中主要的細菌種群。事實證明，長期開展生產的車間內已形成一定多樣性、與釀造環境相適應、相對穩定、有益于釀酒的微生物群落。

3 功能性釀酒微生物在釀酒副產物綜合利用等方面的應用

白酒行業的副產物資源化再利用既符合國家節能減排的政策導向，也能為企業創造一定的經濟效益。酒糟的再發酵不僅產品安全性高，而且符合國家環保政策，丟糟酒與基礎酒的融合性也好，不會出現使用外加物容易導致的浮香、味短、香味協調性差等問題，對保障和提高酒體質量也有較大益處。白酒行業的副產物資源化再利用既可應用在傳統固態白酒中，滿足國家標準中不得加入非自身發酵物質的規定，也能在新型白酒生產中使用。

3.1 利用酒糟制備有機飼料

白酒釀造中所產生的釀酒副產物酒糟，顏色呈淺褐色，味道具有發酵谷物的特點。酒糟不僅含有相當比例的無氮浸出物、還含有豐富的粗蛋白（見表1），經過加工制備的有機飼料作為牛和羊的主要飼料有很好的適口性和容易消化的特點，這是農作物秸稈所不能比擬的，而且還能有效預防牛羊發生瘤胃膨氣，是一種物美價廉飼喂牛羊的飼料原料[11]。

表1 酒糟的分析檢測結果

分別以濃香型白酒酒糟和清香型白酒酒糟原料進行對比性實驗，添加黑曲霉麩曲、細菌麩曲、酵母麩曲等進行堆積糖化發酵，待發酵結束后，再添加其他營養成分，烘干粉碎后得到微生物菌體蛋白飼料。黑曲霉麩曲中富含纖維素酶、糖化酶、淀粉酶等，在發酵過程中，其能很好地分解酒糟中的植物粗纖維素、殘余淀粉等；細菌麩曲中的蛋白酶等，可以分解酒糟中的粗蛋白等，有利于為酵母等微生物的生長繁衍提供物質基礎；酵母麩曲經過擴大繁殖，產生大量的酵母菌體蛋白，菌體蛋白含有豐富的氨基酸等營養元素，并有助消化、改善飼料的適口性等。

3.2 利用酒糟回窖發酵制備丟糟酒

將現代生物工程技術與傳統釀造發酵技術相結合，利用自轉化育種功能性菌株及各種釀酒發酵有益菌株，研制開發出各類新型微生物菌劑，既可有效利用和降低各類白酒生產原材料中殘余淀粉含量，提高釀酒原料的利用率，增加出酒率，減少廢棄丟糟的排放；還可根據不同消費群的飲食文化的嗜好，采用不同微生物菌種配合和工藝改造，生產出具有不同風格特點的新產品類型，實現經濟、社會及環保效益的和諧統一。借助白酒微生態研究構建的白酒菌種庫及信息資源庫，運用現代生物工程技術實現傳統釀酒工藝中廢棄物資源的高效利用。將傳統制曲工藝與復合酶、復合酵母配合技術相結合，制作而成的具有較高的產酯能力和出酒率的丟糟專用釀酒微生物制劑，其釀造生產的丟糟酒風格獨特，長期貯存后可以作為特殊調味酒使用，提高了酒企丟糟利用的綜合效益，還有利于實現酒糟的綜合循環利用，進一步解決酒糟處理污染環境的問題。

3.3 利用黃漿水制備生物酯化液

黃漿水是固態發酵白酒的副產物，呈棕黃色，是黏稠的混合物，其中含有豐富的有機物、粗淀粉、微生物菌體等。黃漿水在經過簡單處理后可以用于勾調酒、強化窖泥保養、沼氣發酵等，還可以利用黃漿水中的大量有機酸制備生產飲料、利用黃漿水中的微生物菌體制備生產微生物菌體蛋白飼料等。在釀酒工藝方面，可以利用黃漿水制備人工窖泥、制備酯化液、強化糧醅發酵等，利用黃漿水制作香醅再用于固態發酵，利用黃漿水進行己酸菌的馴化培養再制備己酸菌液體或人工窖泥使用，黃漿水的綜合利用價值較高。黃漿水中含有大量氨氮化合物、糖類、酸、醇、酯等呈香物質以及有益微生物群（見表2），其中，酸（如乙酸、丁酸、乳酸）、酯（如乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯）、雜醇油等含量很高，直接利用難以實現。如何間接利用黃漿水提高產酒的質量及減少環境的污染成為很多酒廠急需解決的技術難題。

通過液體培養獲得黑曲霉種子液，再向液態體系中添加適量的黃漿水、酒尾、食用酒精、大曲粉、酒醅、酯化紅曲、復合己酸菌液等物料，并調整pH值，控制液態發酵溫度及時間，獲得可用于白酒釀造生產的酯化液，并將酯化液應用于灌窖或串蒸工序中，以提高濃香型白酒的質量。通過微生物液態發酵制備酯化液，充分利用黑曲霉液態發酵產生的復合酶類促進酯化作用，提高了液態發酵體系的酯化效率，并有效利用釀酒副產物中的有機酸、酯類等物質，在提高資源綜合利用率等方面起到了積極作用。

表2 黃漿水主要成分的常規理化分析檢測結果

利用黑曲霉與黃漿水及其他副產物制備的生物酯化液，能夠很好地利用黃漿水中的有益成分。圖4為黃漿水原樣(a)與處理后排放樣(b)的色譜圖，由圖4可知：經過處理利用后排放的黃漿水中，乳酸、乙酸、雜醇油的含量很高，排放的黃漿水中含有大量對釀酒生產無益的物質，此時排放的黃漿水再經污水生化處理，可大大減輕原污水處理設備的壓力，減少了環境污染，同時也為企業增加了經濟效益。

4 討論與總結

圖4 黃漿水原樣(a)與處理后排放樣(b)的色譜圖

通過對窖泥、酒醅、大曲及釀造環境等部分功能性釀酒微生物的篩選、鑒定，并研究其代謝特征與機制，開展液體發酵產香分析、生產應用評價等研究。根據功能性釀酒微生物的代謝機理，通過液體擴培、人工窖泥、強化制曲等方式，實現對關鍵功能性釀酒微生物及特種功能性酶類的有效控制，調控白酒固態混合發酵體系代謝產物，豐富白酒中特色風味物質，提高生產效率和產酒品質。功能性釀酒微生物的研究及其應用，有助于對固態發酵白酒風味物質的特征及其形成機理進行分析，并結合現代風味化學研究，應用微生物生香發酵工程，調控窖池內釀造微生物的發酵、生香過程，實現對形成風味物質的功能性釀酒微生物及其代謝途徑的調控，可以為增強濃香、清香等固態發酵白酒的典型風格、口感特色及其品質特征提供依據，將滿足我國白酒釀造生產的現實需求，進而產生較好的經濟和社會效益。功能性釀酒微生物在酒糟、黃漿水等釀酒副產物的綜合利用等方面起到積極的推動作用，有助于解決釀酒行業的環境污染等問題，發展釀酒循環經濟，促進白酒產業及其綠色釀造生產的長遠發展。