2017年中國部分地區白斑綜合征病毒高變異區的序列分析

劉曉娉，孫新穎，劉慶慧，萬曉媛，黃 倢

（1．青島海洋科學與技術國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，農業部海水養殖病害防治重點實驗室，青島市海水養殖流行病學與生物安保重點實驗室，中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東青島 266071；2．上海海洋大學，上海 201306；3．濟南大學前沿交叉科學研究院，山東濟南 250022）

白斑綜合征病毒（WSSV）自20世紀90年代首次在中國臺灣地區暴發，隨后迅速傳播至東南亞、印度及南北美洲的許多國家［1-2］，給世界各地的對蝦養殖產業造成了重大的經濟損失［3-5］，同時也破壞了海洋生態系統的平衡［6］。WSSV的宿主范圍較為廣泛，可感染40余種甲殼綱動物以及水生浮游動物，并表現出不同程度的感染性［7］，這種廣泛的宿主范圍被認為是WSSV難以控制并大面積傳播的主要原因。

目前在Genbank上公布了7種WSSV病毒分離株的基因組全序列，包括中國的中國臺灣株（TW，AF440570，307 287bp）和中國（大陸）株（CN，AF332093，305 107bp）、（CN01，KT995472．1，309 286bp）、（CN02，KT995470．1，294 261bp）、（CN03，KT995471．1，284 148bp）、韓國的韓國株（KR，JX515788，295 884bp）以及泰國的泰國株（TH，AF369029，292 967bp）［8］。盡管總核苷酸序列同一性大于99%，但鑒定出了5個可變基因座，其由兩個具有基因組缺失的區域（ORF14／15和ORF23／24缺失區）和3個具有重復單元變化差異（VNTR）的基因座（ORF75、ORF94和ORF125）構成［9］。目前對于WSSV分子病學的研究調查均涉及到 ORF14／15、ORF23／24的缺失情況以及ORF75、ORF94和ORF125的 VNTR數目和單核苷酸多態性的變化。PRADEEP等［10］將ORF14／15、ORF23／24這兩個變異區列為 WSSV分子流行病學、遺傳進化追溯的首選對象。基因組重復區域ORF75、ORF94和ORF125的VNTR有助于研究WSSV在小地理范圍尺度上WSSV的分子流行病學的情況［11］。

本研究針對中國凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）不同養殖區2017年2—6月期間采集的病蝦進行檢測。共選取42個WSSV陽性樣本進行 ORF14／15、ORF23／24、ORF75、ORF94和ORF125共5個可變區的PCR擴增進行測序，分析各序列的缺失變異情況以及ORF75、ORF94、ORF125擴增序列的重復單元數目及單核苷酸多態性的變化，以期為了解不同凡納濱對蝦養殖區WSSV各毒株間的差異及分子流行病學特征提供參考資料。

1 材料與方法

1．1 樣本來源

2017年2—6月，采集來自中國河北、浙江、山東、上海、福建和廣東共6個不同省市凡納濱對蝦養殖區的病蝦，保存于-80°C冰箱，樣品的采集時間、地點及編號見表1。

1．2 WSSV核酸提取

從保存的樣本中取約30 mg鰓組織，按照海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，離心柱型）的說明進行 DNA提取，將提取的DNA樣本置于-20℃冷凍保存待用。

1．3 PCR檢測

對 WSSV DNA樣本采用“GB／T 28630．2-2012白斑綜合征（WSD）診斷規程 第2部分套式PCR檢測法”為標準進行檢測。PCR產物通過用1×TAE電泳緩沖液配制的1%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1．4 PCR擴增

將WSSV陽性樣本通過各可變區ORF14／15、ORF23／24、ORF75、ORF94和 ORF125的特定引物進行PCR擴增，PCR擴增體系總量為25 μL，分別為：12．5μL PCRMix（Takara），9．5μL無菌水，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL陽性核酸為模板。PCR擴增反應程序及引物序列見表2。

表1 凡納濱對蝦樣品采集信息Tab．1 Sampling information of Litopenaeus vannamei

表2 PCR擴增的引物序列信息及反應條件Tab．2 PCR primers and cycling conditions

1．5 目的基因克隆及序列比對分析

將PCR擴增產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠投影儀中將特異性條帶回收至1．5 mL離心管中，利用膠回收試劑盒進行PCR擴增產物的純化。利用Nano Drop2000檢測膠回收產物的濃度，連接于pMD?18-T載體上并轉化入Top10感受態細胞中進行擴增，將陽性克隆進行菌液培養，最后將菌液送至生工生物工程（上海）有限公司測序部。將ORF14／15序列與TH-96-Ⅱ分離株進行比對，ORF23／24與中國臺灣株進行比對，并分析ORF75、ORF94和ORF125重復單元數目及單核苷酸多態性的變化。

2 結果與分析

2．1 ORF14／15擴增結果

通過對WSSV樣本的擴增，共有28份（2#、3#、5#、7#、11#、12#、13#、14#、15#、16#、17#、18#、19#、20#、22#、23#、25#、26#、27#、28#、30#、31#、32#、33#、34#、35#、37#和 40#）樣本出現了ORF14／15的檢測條帶，一個泳道內均出現了兩條大小不一的條帶，這可能是由樣品中DNA的斷裂或片段不完整造成的。能夠成功擴增樣品的比率為66．67% （圖1）。

2．2 ORF23／24擴增結果

在 ORF23／24擴增中，有 9份（7#、9#、11#、13#、14#、27#、28#、29#、40#）樣本可以擴增出條帶，能夠成功擴增樣品的比例為21．43%。7#、9#、11#、13#、14#、27#、28#、29#、40#9份樣品長度均為1 265 bp（圖2）。

2．3 ORF75擴增結果

在ORF75擴增中，共有7份樣本檢出（7#、9#、11#、14#、27#、37#、40#），檢出率為 16．67%（圖3）。

圖1 ORF14／15的PCR擴增電泳結果Fig．1 PCR amplification electrophoresis results of ORF14／15

2．4 ORF94擴增結果

在ORF94擴增中，只有東營（37#）的樣本有目的條帶檢出，其余地區樣本出現特異性條帶，檢出率為2．38%（圖4）。

2．5 ORF125擴增結果

在ORF125擴增中，共有13份樣品檢出（7#、8#、9#、10#、11#、13#、14#、27#、28#、29#、36#、37#、40#），檢出率為30．95%。共出現4種大小不同的條帶，分別為652、633、790、859bp（圖5）。

圖2 ORF23／24的PCR擴增電泳結果Fig．2 PCR amplification electrophoresis results of ORF23／24

圖3 ORF75的PCR擴增電泳結果Fig．3 PCR amplification electrophoresis results of ORF75

圖4 ORF94的PCR擴增電泳結果Fig．4 PCR amplification electrophoresis results of ORF94

圖5 ORF125的PCR擴增電泳結果Fig．5 PCR amplification electrophoresis results of ORF125

2．6 序列比對

在ORF14／15擴增中，共有4種大小不一的片段擴增出來，即1 270 bp（深土鎮、霞美鎮、黃驊、臺州、海陽）、1 267 bp（深土鎮、霞美鎮、臺州）、1 850 bp（霞美鎮、上海）和 1 851 bp（湛江），同推測有最長序列的 TH-96-Ⅱ比對，共有4種缺失情況，即缺失 6 530、6 533、5 950、5 949 bp。

圖6 WSSV不同毒株ORF14／15擴增區域序列比對Fig．6 Scheme of deletion region of ORF14／15 in different WSSV strains

在ORF23／24的擴增中，只擴增出一種長度的大小，即1 265 bp。與此區域的中國臺灣株比對，缺失了11 945 bp。

圖7 WSSV不同毒株ORF23／24區域的序列比對Fig．7 Scheme of deletion region of ORF23／24 in different WSSV strains

ORF75具有長度為102 bp和45 bp兩種類型的重復單位。其中102 bp片段的前45 bp的堿基與45 bp的重復單元序列一致。ORF75主要擴增出3種不同大小的片段，分別為：1 739 bp（霞美鎮、上海）、2 019 bp（湛江）和 2 310 bp（東營）。將測得的目的片段與重復單元序列比對，結果表明45 bp的75RU數目對應為：2、3、6，而102 bp的 75 RU數目對應為：1、1、3，表 3為ORF75（45 bp）區域各重復單元在 12、27、80位點的單核苷酸多態性。

表3 ORF75（45 bp）區域各重復單元在各位點的單核苷酸多態性Tab．3 Single nucleotide polymorphisms（SNPs）at various sites in repeated units（RUs）of ORF75（45 bp）region

ORF94只擴增出一條特異性條帶，長度為646 bp（東營）。ORF94只存在一種重復單元，大小為54 bp，其重復單元數目及單核苷酸多態性見表4。

表4 ORF94區域各重復單元在48位點的單核苷酸多態性Tab．4 Single nucleotide polymorphisms（SNPs）patterns at position 48 in RUs of ORF94 region

ORF125擴增序列大小分別為：652 bp（霞美鎮、湛江）、633 bp（湛江）、790 bp（濱州）和 859 bp（東營、上海）共4種。其中652 bp和633 bp的重復單元數目為4，790 bp重復單元數目為6，859 bp的重復單元數目為7。RUs為4的霞美鎮和湛江的樣品共出現6個堿基位置的突變，分別在第9、12、27、50、53、61位的堿基為 G、T、G、G、C、C。RUs為6的36號樣品共出現7個堿基位置的突變，第20位堿基突變為G，它堿基突變與RUs為4的情況相同。RUs為7的37和40號樣品也是出現6個堿基的突變，分別在第9、12、27、50、53、61位的堿基為 G、T、G、G、C、C。表 5為ORF125擴增序列重復單元數目及在各個位點的單核苷酸多態性。

表5 ORF125區域各重復單元在各位點的單核苷酸多態性Tab．5 Single nucleotide polymorphisms（SNPs）at various sites in repeated units（RUs）of ORF125 region

3 討論

白斑綜合征病毒在核苷酸序列水平上的缺失變異情況是研究其遺傳進化差異的重要內容，差異序列的存在可能對不同WSSV分離株的致病力產生影響。ORF14／15、ORF23／24、ORF75、ORF94、ORF125這5個可變區目前常被用作遺傳標記來鑒定WSSV分離株的變異并分析其病毒擴散模式［12-14］。在目前公布的WSSV全基因組序列中，起源于泰國株的WSSV-TH-96-Ⅱ具有最大的基因組序列，約為312kb，被假定為祖先株［15］。一般將 ORF14／15的擴增序列與 TH-96-Ⅱ進行比對分析，韓國株相對于TH-96-Ⅱ株缺失5 721 bp，與本研究中5 949 bp和5 950 bp大小的缺失片段相近。在 MARKS等［16］關于越南地區WSSV分離株 ORF14／15的擴增中，17種WSSV-VN分離株中有12種有相同的6 030 bp大小的缺失。在TANG等［17］針對馬達加斯加島、莫桑比克和沙特阿拉伯地區毒株的實驗中發現，ORF14／15的序列缺失片段為5 950 bp，本研究中涉及到福建霞美鎮和上海地區的樣本5 950 bp大小的缺失情況與其一致。另外兩種片段差異性在于1 850 bp相較于1 851 bp在第990位缺失了一個堿基A。孫新穎等［18］關于浙江、廣州、河北黃驥、山東、天津、江蘇地區的ORF14／15擴增中出現6 530 bp大小的缺失片段，本研究中福建、河北、浙江和山東地區樣本的缺失情況與其一致。本研究中ORF14／15的缺失情況均為大片段的缺失，且缺失片段大小差異不明顯，推測ORF14／15的變異是為了感染其它宿主物種的適應策略。

在本研究中ORF23／24擴增序列的缺失片段大小均為11 945 bp，除去缺失部分序列與CN株100%相同。DIEU等［19］在越南中部和南部地區WSSV分離株的 ORF23／24擴增中顯示出8 539～12 166 bp的缺失。在我國2014年河北、遼寧、江蘇、浙江、廣東地區的研究樣本擴增中缺失片段大小為 12 064 bp［18］，2015年山東、浙江、天津、海南地區缺失片段大小為12 070 bp［20］。綜合以上結果表明，ORF23／24的擴增受地理環境的影響不大，而且缺失大小差異也不明顯，均為大片段的缺失，推測較大片段的缺失會給WSSV帶來復制優勢和對外部環境適應性的增加。

本研究中ORF75的總RUs數目為3、4、9共3種類型，其中45 bp的數目為2、3、6，102 bp的數目為 1、1、3。DURAN-AVELAR等［21］發現，ORF75的RUs數目介于5～20之間，DIEU等［22］在越南發現了7RUs的單倍型，其中包括6個45 bp的RUs及1個102 bp的 RU。在2015年山東、天津、浙江地區的研究樣本中總ORF75的RUs數目為 2、3、4［20］，陳紅蓮等［23］在 2016年安徽合肥、六安、滁州的樣本中檢測出3、6、9、10和11共 5種 RUs。相較于國外，國內部分地區ORF75 RUs出現了2和3兩種較小的RUs。

ORF 94的RU為54 bp，本實驗僅擴增出一個樣本。WONGTEERASUPAYA等［24］在研究2000—2002年間泰國地區 WSSV樣品時顯示ORF94的RUs差異很大，范圍從6～20 RU。目前在國內外的研究報道中其RUs數目介于2～20之間，其中 6RUs為常見基因型［25］，與37號（東營）樣品的RUs數目一致。除此之外，其重復單元會在第48位出現單核苷酸多態性。分析37號樣本序列，發現其在48位的堿基為 T、T、T、T、G、G，與 SINDHUPRIYA等［26］在 ORF94擴增中 SNP的研究結果一致。表現出了單核苷酸多態性位點低頻率的變異情況。

相對于 ORF75和 ORF94的檢出情況，ORF125的檢出率相對較高，為30．95%，其RUs數目分別為4、6、7。其中6RUs和7RUs兩種基因型常分布于越南［27-29］，同時在2016年安徽省的六安、合肥、蕪湖、滁州以及池州的樣本中也出現了相同的兩種重復單元數目［23］。而在2015年山東、天津、浙江、海南地區以及2016年日照、唐山、黃驊、滄州、秦皇島、寧波地區ORF125的RUs分別為 3、5、6和 4、5、6［20，30］，本實驗 VNTRs的研究結果與其差異較大。研究結果表明，ORF125的VNTRs在不同年份受地域環境及地區的影響相對較小，出現較多的交叉情況，有一定的規律可循。除此之外，福建霞美鎮及廣東湛江的樣品與以往研究相同，均在 9、12、27、50、53、61位點出現了堿基突變［20］，表現出ORF125的SNP均一性及穩定性。

本研究通過對2017年樣品的擴增發現，相較于2014—2015年的研究結果，ORF14／15的缺失程度有所增大，而ORF23／24的缺失片段大小差異并不明顯，表現出不同地區及年份的穩定性。ORF75、ORF94、ORF125的 RUs及 SNP表現出高度多態性的同時并有一定規律可循。據此推測較大程度的缺失以及重復單元數目的變化可能受環境選擇壓力的影響，更有利于病毒的復制及傳播，而其對WSSV的毒力大小是否產生影響還需要進一步的探究。