基于宏基因組學的中國沿海密集養殖水域秋季底質細菌多樣性研究

高權新，李云莉，齊占會，岳彥峰，施兆鴻，彭士明，高 陽

（1．湖州師范學院生命科學學院，浙江湖州 313000；2．浙江海洋大學水產學院，浙江舟山 316022；

3．中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；4．中國水產科學研究院南海水產研究所，廣州 510300）

我國的水產養殖產量占世界水產養殖總量的70%以上，也是全球最大的海水養殖國家和世界上唯一一個養殖產量超過捕撈產量的國家［1］。近年來，隨著我國沿海水產養殖規模不斷擴大，污水入海、違規開發、藥物濫用等問題日益突出，導致近海海域污染持續加重，水產病害頻發。在巨大的海洋生態系統中，微生物是非常重要的組成部分，其結構組成和代謝產物對環境具有指示作用［2］。微生物群落組成與海洋的水質狀況聯系緊密，能間接反映出海洋的水體特征，并能影響海洋物種的生存和繁衍［3］。此外，水生環境淤泥中微生物群落是水生生態系統營養因子循環和能量傳遞的主要驅動力［4］，所以深入剖析微生物的群落組成與分布特征對于海洋微生物的生態學研究具有重要意義。

傳統的微生物結構研究方法局限性在于僅對部分細菌或可培養細菌分布特點進行分析［5］，近年來，隨著分子生物學技術在環境生物研究中的快速發展和應用，國內外專家學者紛紛利用最新的菌落鑒別技術對我國沿海微生物多樣性展開調研［6-9］。目前有關我國典型養殖水域微生物多樣性的研究尚較缺乏，且相關研究多局限在某一水域，沒有對我國重要海水養殖水域進行全面、系統的深入分析［10］。為此，本實驗采集了我國沿海10個養殖密集水域和1個無養殖活動對照水域的底泥樣品，通過 de novo測序，借助IlluminaMiSeq測序平臺對所采集樣品中的微生物群落結構進行全面、系統的分析，旨在為我國沿海養殖水域微生物研究和環境管理提供基礎數據和科學依據。

1 材料和方法

1．1 樣品采集

本研究于2015年9—10月從中國沿海養殖密集水域采集底泥樣品，所選取的10個典型海水養殖區域包括大連、唐山、蓬萊、連云港、啟東、象山、寧德、東山、湛江、陵水，并設美濟礁為對照水域（表1），美濟礁位于中國南海，該水域沒有養殖活動，所以本研究將其作為對照。分別在每個水域10個不同的點進行采樣，然后混合、攪勻，并將混合后的樣本作為這個水域的底泥樣進行檢測分析。底泥樣品收集后，立即用密封袋封存，低溫運輸，在本實驗室-80℃保存備用。

1．2 細菌的多樣性分析

提取樣品中的DNA，構建文庫并測序。采用Illumina NextSeq 500測序平臺，對原始數據進行去接頭和質量過濾，最后再進行連接處理和拼接。所得序列與多個數據庫比對注釋并統計相應豐度。獲取注釋及豐度信息后，從物種豐度與基因豐度兩個角度進行細菌的多樣性分析。

1．3 生物信息學分析

將有效數據在97%的相似水平上劃分為不同的OTU，將OTU代表序列與相應的微生物數據庫比對，利用Greengene數據等數據庫對物種進行注釋，從而得到每個樣本所含的物種信息。通過對OTUs進行Alpha多樣性指數、豐度等分析，并對物種注釋在各個分類水平上進行群落結構的統計分析，得到細菌群落的組成信息，再通過Beta多樣性分析，系統分析密集養殖水域底泥樣本間的微生物群落結構差異。

1．4 統計分析

運用Uparse軟件進行OTU聚類分析，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OUT代表序列進行分類學分析；利用Qiime軟件、R軟件、Mothur軟件等進行物種豐度、多樣性和群落結構分析。

2 結果與分析

2．1 Alpha多樣性分析

Chao指數和ACE指數可以用來描述整個群落的豐富度（不考慮群落中每個物種的豐度情況），Shannon指數和Simpson指數可以用來描述一個樣品的細菌多樣性。由表2可以看出，樣品ND的 Simpson指數最高，其次是樣品 DL；而Shannon指數值最高的是樣品DL，其次是樣品ND，并且兩個樣品的Simpson指數和Shannon指數相差不大，說明這兩個區域的群落多樣性較高，這可能和這兩個區域的地理位置以及養殖品種相關。此外，樣品ND的Chao指數和ACE指數最高，分別為652．0和670．8，說明該區域的群落豐富度最高，其次是樣品DL。總的來說，各采樣點的群落豐富度和多樣性存在著一定的差異，其中以MJJ和QD的豐富度和多樣性最低。

表1 采樣點和主要養殖品種Tab．1 Sampling locations and major cultured species

表2 各采樣點生物多樣性指數Tab．2 Biodiversity index of each sampling site

2．2 群落結構分析

由3D PCoA圖（圖1）可見，樣品LYG和QD之間有重疊的部分，這說明樣品LYG和QD的細菌群落組成相似。其次，樣品ND和DS之間的距離也較近，這表明樣品ND和DS的細菌群落組成差異較小，這與NMDS分析圖（圖2）顯示的結果一致。利用NMDS分析底泥細菌群落組成，壓力系數為0．012 647，說明可以較好地反映各采樣點間細菌群落的相似性。此外，樣品LS與其它樣品之間的距離都比較遠，這說明LS與其它采樣點之間的微生物群落差異較大，這可能與當地的養殖品種以及生態環境相關。

圖1 各采樣點樣品的3D PCoA圖Fig．1 3D PCoA figure of samples from each sampling site

圖2 各采樣點樣品NMDS分析圖Fig．2 NMDSanalysis chart of samples from each sampling site

為比較各樣品間的細菌群落結構的差異，本研究對11個樣品做了基于屬水平的主成分分析（principal components analysis，PCA圖，圖 3）；其中第1主成分（PC1）的貢獻率為 69．46%，第2主成分（PC2）貢獻率為21．55%，兩者累積貢獻率為91．01%，因此能客觀反映各樣品間微生物群落結構上的差異。如圖3所示，幾乎所有的點都位于圖的上方，除了樣品PL的點位于圖的下方，并且與其它點之間的距離較遠，由此可知，樣品PL與其它樣品之間的細菌群落差異較大。

圖3 各采樣點樣品基于屬水平的主成分分析（PCA）Fig．3 Principal component analysis（PCA）of samples from each sampling site based on genus level

Heatmap可將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，從而顯示每個樣品中細菌群落的多樣性（圖4）。從圖4可以看出，樣品DL、PL和XS都具有明顯且較大的紅色區域，這說明這些紅色區域所覆蓋的細菌數量較大，也就是這3個水域的底泥中含有較多高豐度的細菌；除了樣品MJJ之外，其它樣品都具有較小的紅色區域覆蓋。從整體上看，各樣品之間細菌群落的豐度差異較大。

由圖5可見，在門水平上細菌群落主要分為兩大類：厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）。其中大部分樣品中，厚壁菌門的群落豐富度高于變形菌門。這與圖6顯示的結果一致。在厚壁菌門中，桿菌綱（Bacilli）的細菌所占總菌的比例最高；另外在芽孢桿菌目（Bacillates）中，主要菌科是動性球菌科（Planococcaceae）和芽孢桿菌科（Bacillaceae）。在屬水平上，占明顯優勢的是芽孢桿菌屬（Bacillus）。在變形菌門中，群落豐度比較高的是變形菌綱（Gammaproteobacteria）中的假單胞菌目下的莫拉菌科（Moraxellaceae）。

3 討論

本研究發現，與我國的養殖水域相比，美濟礁水域（非養殖水域）微生物的豐富度和多樣性均較低，這說明我國沿海水域微生物的群系組成受水產養殖活動影響巨大。因為我國沿海水產養殖規模的不斷擴大，每年都有大量的有機物質、營養鹽、抗生素等輸入近海，這導致沿海水環境遭受嚴重污染［11-12］。有研究指出［13-14］，我國近海有機污染已明顯改變了浮游細菌群落的結構。海水養殖過程中浪費的餌料、水產動物的排泄物和抗生素殘留以及人類的生活垃圾等都會增加底泥的有機物含量和藥物殘留，從而導致微生物的結構發生改變。微生物群系是環境變化、波動的首要響應者，可用于評估自然或人為活動對環境的影響。越來越多的專家學者建議將微生物群落的特征作為評價海洋生態系統穩定與健康的重要指標［15］。戴文芳等［13］篩選了與有機物污染狀況顯著相關的23個菌科，并推薦將其作為潛在有機污染的指示種群。

本研究通過分析生物多樣性指數發現，不同養殖水域底泥細菌群落的豐富度和多樣性存在著較大的差異。國外有學者對不同海域沉積物中的細菌群落做了多樣性分析，發現不同海域沉積物中細菌群落的豐富度存在著一定的差異［9-11］，本實驗的研究結果與其相似。究其原因［11，16］，首先，不同的水域遭受有機物污染的程度不一，水體富營養化污染情況也復雜多樣，且水環境中的藥物殘留、總氮、硝酸鹽、溶解氧等環境因子可能存在較大的差異；環境因子的動態變化會促使某些細菌成為優勢菌，從而影響整個水生系統中細菌群落的組成［17］。其次，除了污染的因素外，微生物的群落組成還與沿海水域的諸多客觀因素有關，比如微生物所處水環境的溫度、鹽度、淤泥的質地、浮游植物、氣候等等［18-23］。此外，除水產養殖外的人類活動也會對水體中細菌的多樣性產生較大影響，比如海上交通、捕撈等都會顯著改變細菌的群落結構，所以有學者提議建立“海洋保護區”，以保存現有的微生物物種［15］。

從本研究的PCoA圖和NMDS圖可以看出，連云港和啟東兩個樣品中的細菌群落組成很相似，根據實地調查了解，兩個水域主要的養殖品種都是文蛤（Meretrix meretrix）和蝦蟹類，所以推測養殖品種的不同也可能是造成微生物群系差異的重要因素。因為養殖品種的食性、飼料類型、排泄廢物以及投放的藥物等皆有不同，養殖動物腸道和水體中微生物群系也存在差異［24］，所以這可能間接導致了近海不同水域微生物群系的不同。

圖4 不同區域細菌的熱圖Fig．4 A heatmap of bacteria from different sites

變形菌門是細菌中最大的一門，包括多種致病菌和益生菌，有報道指出其在我國主要的河流和近海中分布非常廣泛，是水生系統中最大的一個門類［25-27］。據相關研究報道［28-30］，變形菌門在我國遼河口、長江口和渤海灣水域中所占總菌的比例分別為 61．94%、50．62%、39．80%，是這些水域生態系統中細菌群落豐度最大的一個門類。在國外亦有類似的報道，ZENG等［31］和ABIA等［32］均發現變形菌門是水生系統中比例最高的菌門；CATANIA等［15］發現變形菌門和厚壁菌門在地中海水域的分布最為廣泛，分別占到總菌的78%和11%。在本實驗中，多樣品物種分布圖和物種群落結構圖顯示，中國典型養殖水域淤泥中的細菌主要為厚壁菌門和變形菌門；且僅在唐山、湛江和美濟礁水域變形菌門所占總菌比例大于厚壁菌門，而在其它水域，厚壁菌門的比例明顯高于變形菌門，這種差異可能是由其所處的沿海水域地理位置的不同造成的。

圖5 不同養殖水域底泥細菌在門水平的相對豐度分析Fig．5 Relative abundance of bacteria in the level of door from different culture areas

圖6 物種群落結構圖Fig．6 Species community structure

本研究發現，中國典型養殖水域中厚壁菌門的豐度要高于變形菌門，并且厚壁菌門中的芽孢桿菌是優勢菌種。芽孢桿菌由于能形成孢子，所以對外界有害因子的抵抗力非常強，在水環境中廣泛存在。研究發現，芽孢桿菌在我國近海分布廣、數量多，且在養殖水體中檢出率高［33-35］，本研究的結果與其一致。另有研究如HUYS等［36］在亞洲南部地區（馬來西亞、泰國和越南）的12個養魚場和對蝦養殖場采樣，通過菌種鑒定發現芽孢桿菌分布廣、豐度大，所占總菌比例為5．9%；GAO等［37］發現芽孢桿菌普遍存在于我國天津水產養殖區域，而且經鑒定發現其包含多種抗性基因。結合國內外的文獻支持，本研究的結果可為我國沿海水域微生物多樣性的研究提供生物信息和數據參考。