富鍶水體處理對大黃魚耳石和肌體中鍶含量的影響

張 輝，姜亞洲，袁興偉，張 翼，蔣宏雷，焦海峰，程家驊，李圣法

（1．中國水產科學研究院東海水產研究所，農業部東海與遠洋漁業資源開發利用重點實驗室，上海 200090；2．寧波市海洋與漁業研究院，浙江寧波 315012）

大黃魚（Larimichthys crocea）是我國近海重要的增殖放流品種，其增殖放流工作開展已有10余年的歷史［1］。基于鍶元素的耳石元素指紋標記是研建小規格大黃魚增殖放流苗種規模化標記技術的重要探索方向［2-5］。該項標記技術主要通過階段性提升增殖放流魚苗飼養水體中鍶元素濃度，使其在處理魚苗特定耳石區位富集，進而達到對處理魚苗耳石元素指紋標記的目標。目前，對于該方面的研究報道較多，我國學者先后報道了大麻哈魚（Oncorhynchus keta）［6］、黑鯛（Acanthopagrus schlegeli）［7］、鳙 （Aristichthys nobilis）［8］等物種的鍶元素耳石元素指紋標記。張輝等［9］也通過富鍶水體浸泡標記實驗，從耳石元素指紋標記建立角度對利用該項技術開展大黃魚魚苗標記的可行性進行了實證研究。但該研究由于未能動態跟蹤標記處理后耳石和肌體中鍶元素含量的變化規律，致使耳石元素指紋標記的穩定性問題和標記過程是否會因提升受試魚苗肌體中鍶元素濃度進而引發食品安全問題等均有待進一步驗證。

鑒于此，本研究擬通過開展富鍶水體對大黃魚魚苗的浸泡標記實驗，在系統分析受試魚苗耳石Sr／Ca值對富鍶水體標記過程的響應方式、探究耳石元素指紋標記穩定性的同時，動態跟蹤受試魚苗肌體和主要臟器中鍶含量的變化規律，以期明確標記過程是否存在相關食品安全性風險。

1 材料與方法

1．1 實驗設計

實驗用大黃魚取自浙江省象山縣象山灣大黃魚苗種繁育中心，為育苗后28 d的幼魚。實驗使用6個1 000 L的圓柱形黑桶，其中3個桶為處理組，另3個桶為對照組，每個桶中置有大約5 000尾大黃魚幼魚，養殖用水為經過三級處理后的天然海水。養殖期間的水溫為20．7～23．0℃，鹽度為 27．0～27．5，pH值保持在 7．8～8．5之間。育苗室的光強控制在1 000 lx以下。每個桶內均勻放置2個充氣石，保持水中氧氣充足。餌料主要投喂天然海區捕撈的活橈足類。根據實驗前的海水測定，該苗種繁育中心的海水Sr2+濃度為（6．07±0．68）mg·L-1。據張翼等［7］研究發現，受試魚苗成功標記的判別標準為任意點位Sr／Ca值均超過標記檢測基線（即對照相應耳石區位Sr／Ca值均值與其3．3倍標準差之和）。鑒于此，本研究中處理組選用原海水3倍Sr2+濃度的富鍶海水，每次換水后，在處理組中加入一定量的SrCl2·6H2O來調節Sr2+的濃度，使得處理組水中的Sr2+濃度保持在18mg·L-1。實驗時間為2015年3月29日—4月4日，共7d。實驗結束后，將各組大黃魚幼魚移至網箱暫養。

1．2 樣品采集

實驗樣品的采集包括實驗前、實驗期間、實驗結束后期3部分：

1）實驗前，從3個處理組和3個對照組中隨機采集大黃魚幼魚樣品各30尾，處理組和對照組分別用T-0和C-0表示（數字表示實驗的天數，以下同）。

2）實驗期間，采集最后一天大黃魚幼魚，采集的樣品包括處理組和對照組的6個桶，每個桶各采集30尾樣品，處理組和對照組分別用T-7和C-7表示。

3）實驗結束后，分11次采集大黃魚幼魚的樣品，第1次為實驗開始后的第8天采集，第2～10次為之后每隔3 d采集一次樣品，第11次即最后一次為實驗開始后的第66天采集樣品。每次采集的樣品包括處理組和對照組的6個桶，每個桶各采集30尾樣品。第1次采集的樣品處理組和對照組分別用T-8和C-8表示，其后的樣品處理組和對照組后面的數字分別以實驗開始后的天數來表示。采樣時間以及處理組與對照組的平均體長見圖1。

圖1 大黃魚處理組與對照組的平均體長變化Fig．1 Variations of average body length between treatment group and control group of Larimichthys crocea

1．3 元素分析

1．3．1 儀器和試劑

肌體消融主要通過SCP DigiPREP石墨消解儀進行消融，肌體元素分析采用Thermo X Series II ICPMS（Thermo Fisher Scientific， Bremen，Germany），耳石元素通過LA-ICPMS進行分析。

肌肉元素分析需要的試劑包含：1）釔標準溶液：1g·L-1，硝酸（2+98）介質；2）內標溶液：取1g·L-1釔標準溶液0．25 mL，加異丙醇10 mL，硝酸10 mL，用水定容至 500 mL，配成含釔 500 μg·L-1的溶液，常溫下可保存至少3個月；3）質譜調諧液：選取10μg·L-1的鋁、鎂、銠、釔溶液為質譜調諧液，硝酸（2+98）介質。

1．3．2 樣品處理

1）耳石處理：樣品處理時，首先取出大黃魚幼魚的矢耳石，參照張翼等［10］的方法將耳石包埋、研磨和拋光，制成厚度約為0．5 mm左右的薄片，用于后續的分析。

2）肌體處理：包括對大黃魚幼魚鰓、腎臟、肝臟和肌肉采集，其中肌肉每次均采集，而鰓、腎臟和肝臟由于分量太輕，不能達到ICPMS儀器的檢測最低限，因此只采集最后一次個體較大的。采集后的樣本分別進行常壓消解，消解的樣本每份在0．50～2．00 g之間，將消解的樣本置于消解罐中后，加入7 mL硝酸，然后將消解罐置于石墨消解儀上進行消解，消解流程參數見表1。消解結束后，待樣本溶液冷卻至室溫，將消解液轉移至50 mL比色管，用去離子水定容混勻，測定前用去離子水稀釋10倍。

表1 常壓消解流程參數Tab．1 Parameters of processing under normal peressure

1．3．3 樣本分析

儀器點火穩定后，通過X-Y軸旋鈕調節炬管位子，并改變等離子條件，使調諧元素的靈敏度及穩定性最佳且干擾最小。

1）耳石元素分析：采用激光線掃描測量，具體的耳石元素檢測方法參照張翼等［10］的方法進行。

2）肌體元素分析：根據樊祥等［11-12］的研究，先將標準溶液引入儀器，再將試劑空白溶液、樣本溶液引入儀器，在線加入內標溶液進行測定，將測定的數據進行分析并繪制標準曲線，計算線性回歸方程。根據樣本溶液中鍶的信號強度，與標準曲線比較，計算大黃魚幼魚樣本中鍶的含量。

1．4 數據分析

為了反映處理組和對照組標記時間段耳石Sr／Ca值之間以及處理組和對照組在標記過程和標記之后的肌肉、鰓、肝臟、腎臟鍶含量之間的差異，本研究利用SPSS 19．0軟件系統中的獨立樣本t檢驗分別對其之間的差異進行比較。

2 結果與分析

2．1 Sr／Ca值組成

通過ICPMS檢測發現，實驗前，所有的大黃魚幼魚耳石在離耳石核心0～0．20 mm處，鍶含量均較高，且不穩定；處理組和對照組耳石中的Sr／Ca并沒有明顯的差別。經過7 d的富鍶水體浸泡處理，可以發現，與對照組相比，處理組大黃魚幼魚的耳石在距離耳石核心0．30 mm處鍶含量開始出現上升的趨勢，且在距離耳石核心0．40～0．50 mm處達到最高峰，并在該區段處于穩定趨勢。隨著富鍶水體浸泡實驗的結束，在距離耳石核心0．50 mm之后開始出現下降趨勢，直至距離耳石核心0．60 mm處，回落至對照組水平（圖2）。該區段處理組與對照組的Sr／Ca值分別為（3．42±0．90）mmol·mol-1和（1．52±1．52）mmol·mol-1。對處理組在該區段的Sr／Ca均值通過獨立樣本t檢驗表明，處理組與對照組之間的 Sr／Ca值有著極顯著差異（P＜0．01）。檢測結果同時表明，在處理組的所有樣品中，在距離耳石核心0．30～0．60 mm區段存在該峰值的樣品魚達到100%。

圖2 處理組和對照組的鍶鈣比值Fig．2 Value of Sr／Ca in treatment and control groups

2．2 肌肉的鍶含量

利用ICPMS進行檢測分析，經獨立樣本t檢驗得出，實驗前，大黃魚幼魚處理組和對照組肌肉中的鍶含量差異不顯著（P＞0．05）。富鍶水體處理的最后一天，大黃魚幼魚處理組和對照組肌肉中的鍶含量差異顯著（P＜0．05），處理組肌肉中的鍶元素平均含量是對照組的2倍多（圖3）。實驗開始后35d內的處理組與對照組肌肉中的鍶含量差異均顯著（P＜0．05），從圖3中可以看出，實驗結束后的4 d內，處理組肌肉中的鍶元素平均含量基本處于穩定的狀態，實驗結束后第7天已經有所下降，且在實驗結束后28 d內一直處于下降的趨勢。實驗開始后第66天，處理組和對照組的大黃魚肌肉中鍶含量差異不顯著（P＞0．05）。

2．3 鰓、腎臟和肝臟的鍶含量

鑒于規格較小的大黃魚幼魚鰓、肝臟和腎臟重量均達不到ICPMS的檢測限，為了確定富鍶水處理的大黃魚幼魚的鰓、腎臟和肝臟是否含有殘留的高濃度鍶，本研究采集了30尾實驗開始后第66天大黃魚幼魚的鰓、腎臟和肝臟進行元素檢測，經ICPMS檢測分析后，利用獨立樣本t檢驗對處理組和對照組的鍶元素含量的差異性檢驗結果表明，處理組和對照組的大黃魚鰓、腎臟和肝臟中鍶元素的含量差異均不顯著（P＞0．05）。

3 討論

小規格的苗種規模化標記一直是困擾我國增殖放流效果評價的主要難題。傳統的標記方法大多適合于個體較大的魚類，而且還面臨工作量大、死亡率高、標簽易脫落等缺點［13］。基于鍶元素的耳石指紋標志技術作為魚類標志放流研究領域中的新興技術，不僅克服了傳統方法上的缺點，而且是一種對苗種規格限制小、便于規模化操作、無標記操作損傷、標記終生攜帶的方法［14-15］。本研究通過開展富鍶水體對大黃魚魚苗浸泡標記實驗，進一步證實了富鍶水體對大黃魚增殖放流魚苗耳石元素指紋標記效果，明確了富鍶水體處理的大黃魚魚苗放流后在肌體中的鍶殘留狀況，驗證了該項技術對于小規格的大黃魚魚苗規模化標記的可行性。

3．1 富鍶水對大黃魚幼魚耳石鍶含量的影響

從圖2中可以發現，大黃魚幼魚耳石核心處的鍶含量較高，很可能是由于親體對幼體的母體效應。在其出膜的第28天，耳石中的鍶含量達到了穩定初期。因此，筆者認為大黃魚出膜的第28天是適合進行鍶元素標記的。根據研究的結果還可發現，在實驗初期，大黃魚幼魚耳石中的鍶含量不斷增加，隨著時間的推移達到一個峰值，最后趨于穩定。實驗結束后，隨著水環境中Sr2+濃度趨于正常，處理組大黃魚幼魚耳石中的Sr／Ca值出現下降的趨勢，該趨勢在實驗開始后的第17天后趨于穩定。鑒于此，可以確定經富鍶水體處理的大黃魚幼魚個體在特定的耳石區段形成的峰可作為區分放流群體和自然群體穩定的鍶標記，而其適合標記的時間為出膜后的第28天至轉移到網箱養殖前。

圖3 大黃魚處理組和對照組肌肉鍶元素平均含量變化趨勢Fig．3 Variation trend of Sr between treatment group and control group in Larimichthy scrocea

3．2 富鍶水對大黃魚幼魚肌體鍶含量的影響

鍶是一種低毒的微量元素［16］，標記放流的大黃魚魚苗在放流后隨著時間的推移有一部分會被人類回捕且用于食用。現階段，我國對于鍶元素的水產品食用安全還沒有一個統一的標準。藺艷等［17-18］研究發現高鍶礦泉水在鍶濃度不超過8 mg·L-1時對細胞增殖有益，其中鍶濃度為4 mg·L-1的效果最突出，主要以延長其增殖周期為主。美國環境保護局規定公共飲用水穩態鍶上限濃度為4 mg·L-1［19］。為了避免富鍶水處理的大黃魚所帶來的相關水產品安全問題，在放流前，標記個體的肌體中的鍶含量應盡量與對照個體保持一致。

根據本研究結果可以發現，經過7 d的18 mg·L-1富鍶水體處理，實驗處理組大黃魚幼魚的肌肉中鍶元素含量最高時達到了110mg·L-1左右。雖然鍶對人體的致死量目前還不清楚，但這一濃度遠遠超過了正常人體鍶的攝入量，因此該階段的大黃魚作為人類的食物而言是不安全的。隨著時間的推移，實驗處理組中的大黃魚幼魚肌肉中的鍶元素含量開始呈現出不斷衰退的趨勢。實驗開始后的第66天，處理組的大黃魚幼魚肌肉中鍶元素含量已降低至正常值。

鰓是魚體的吸收和排泄器官，腎臟是魚體的排泄器官，肝臟則是魚體的解毒器官［19-20］。為了確定魚體各器官的鍶含量的變化，本研究檢測了經18 mg·L-1富鍶水處理的大黃魚幼魚鰓、腎臟和肝臟鍶含量的變化。但由于實驗中的大黃魚幼魚個體的鰓、腎臟和肝臟的重量均達不到ICPMS的檢測限，因此，只是對實驗開始后第66天大黃魚幼魚的鰓、肝臟和腎臟進行檢測，通過檢測，發現66d的處理組大黃魚幼魚鰓、肝臟和腎臟中鍶含量水平均達到了正常范圍。

根據浙江省大黃魚增殖放流技術規范標準，可以發現大黃魚苗種放流的規格為平均體長不小于5cm［21］。從本研究的圖1可以發現，實驗開始后的第66天大黃魚幼魚的體長為5 cm左右，達到了大黃魚放流的標準。鑒于上述，可以提議，在增殖放流效果標記的過程中，可以把經富鍶水處理的大黃魚進行暫養，待其肌體中的鍶元素恢復正常水平后再進行放流，確保消除富鍶水體處理過程中產生的鍶元素超標而引起的食品安全隱患。