以Lorke法為基礎的半致死劑量分析法在油酸和化香樹果序及黃連素抗鎘減毒評價中的應用

房志家 孫力軍 王雅玲 劉穎 聶芳紅

摘要? ? 鎘污染嚴重威脅著農業的健康發展，如何有效抗鎘減毒是保障農業生產安全的重要措施。然而，目前缺乏高效的抗鎘藥物及簡便易行的評價方法。本試驗借助Lorke法為基礎的半致死劑量（LD50）分析方法，檢測了油酸、化香樹果序、黃連素等不同潛在的抗鎘化合物的減毒作用。通過改良后的Lorke法測定不同抗鎘藥物對小鼠的經口鎘LD50的影響。結果表明，與200 mg/kg VC相比，灌胃200 mg/kg油酸、化香樹果序、黃連素能夠減輕鎘的毒性，提高鎘的LD50。LD50由140～160 mg/kg分別上升至300～320 mg/kg（油酸組）、280～300 mg/kg（化香樹果序組）和320～340 mg/kg（黃連素組）。以上結果表明，以Lorke法為基礎的LD50分析方法，能夠評價出油酸、化香樹果序、黃連素的減鎘毒作用及其劑量-效應關系。以上結果同時證明了相同劑量下黃連素效果要優于油酸、優于化香樹果序。

關鍵詞? ? 鎘毒性;油酸;黃連素;化香樹果序;半致死劑量

中圖分類號? ? S917.4? ? ? ? 文獻標識碼? ? A? ? ? ? 文章編號? ?1007-5739（2019）09-0202-02

Abstract? ? Cadmium pollution is a serious threat to the development of agriculture，control and reduction of cadmium is an important way to ensure the safe of agricultural production.However，effective methods for controlling and evaluating cadmium toxicity are not available currently.To effectively reduce the toxic and adverse effects caused by cadmium，the LD50 analysis method based on Lorke method was used to evaluate the attenuating effect of oleic acid，Platycarya strobilacea caryopsis and berberine on cadmium toxicity.The modified Lorke method was used to determine the effects of different anti-cadmium drugs on transoral cadmium LD50 in mice.The results showed that 200 mg/kg of oleic acid，P.strobilacea caryopsis and berberine could reduce the toxicity of cadmium and increase the LD50 of cadmium in mice compared with 200 mg/kg of vitamin C.Their LD50 of cadmium rose to 300-320 mg/kg，280-300 mg/kg and 320-340 mg/kg，respectively.The results indicated that the LD50 analysis based on Lorke method was feasible to evaluate the attenuating effect of oleic acid，P.strobilacea caryopsis and berberine on cadmium toxicity，as well as the relationship between dose and effect.The results also proved that the attenuating effect of berberine on cadmium toxicity was better than that of oleic acid and P.strobilacea at the same dose.

Key words? ? cadmium toxicity;oleic acid;berberine;Platycarya strobilacea caryopsis;median lethal dose

工業發展在推動農業生產的同時，也帶來鎘等極具破壞性的污染物[1-3]。鎘嚴重損害作物生長，更嚴重損害動物肝腎功能，導致臟器損傷[4]，產生極強的毒副作用[5-6]。如何有效降低鎘對畜牧業的影響是農業部門關注的重點問題[7]。

半致死劑量（LD50）作為評價毒物毒性的重要指標，在毒物毒性評價、聯合用藥安全性方面有著重要的應用價值。即使在不同毒物之間、不同動物之間，根據LD50同樣能夠評價出毒物的毒性強弱變化。然而，試驗動物作為食品、藥品評價中的“活天平”，在精確評價藥物的毒性時，往往需要犧牲大量動物進行反復檢測才能評價出毒性強弱。如常規的LD50測定試驗通常需要小鼠70只左右[8]，霍恩氏（Horn）法需要40 只小鼠，孫瑞元改良的寇氏（Karbor）法一般也需30只左右的小鼠[9]，而使用試驗動物最少的Lorke法僅需13只小鼠[10]。

本試驗以使用試驗動物最少的Lorke法為基礎，并以本團隊前期發現的油酸等抗鎘化合物作為試驗藥物[11]，以期為降低鎘污染的影響提供有益數據，并拓展以Lorke法為基礎的LD50分析法在毒性評價中的應用。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗動物及主要試劑

試驗所用小鼠為SPF級昆明小鼠（約30 g），購于廣東廣州中醫藥大學試驗動物中心。氯化鎘（>99%，AR級）、油酸（AR級）、鹽酸黃連素（>99%，CP級別）、VC（>99%，USP級）等，購于上海生物工程有限公司。

1.2? ? 以Lorke法為基礎的LD50急性毒性試驗

1.2.1? ? LD50劑量范圍試驗。基于Lorke法[10]，將新購買的小鼠適應性飼養7 d后，隨機分成3個不同的藥物組和2個對照組，每個藥物包含低、高2個劑量。每個藥物組的小鼠給予灌胃30、100、300 mg/kg氯化鎘，每個劑量3只小鼠。每個藥物組18只小鼠，對照組為9只小鼠，每個劑量下分配3只小鼠作為重復試驗，共72只，分組情況見表1。給藥24 h內，統計小鼠死亡情況，計算LD50所在范圍，并在該范圍內依據Lorke法設定4個新的氯化鎘劑量。

1.2.2? ? LD50測定試驗。基于1.2.1試驗結果，設立4個新的氯化鎘劑量，每個劑量下隨機分配1只小鼠。給藥24 h內，統計小鼠死亡情況，并計算LD50。

2? ? 結果與分析

2.1? ? LD50劑量范圍初步測定

本文根據Lorke法進行急性毒性試驗，在灌胃30、100、300 mg/kg氯化鎘的同時，灌胃油酸、黃連素、化香樹果序等潛在鎘毒緩解藥物。在給藥24 h內，對小鼠進行觀察，并統計死亡情況，結果見表2。可看出，對照組未給予鎘毒緩解藥物時，100 mg/kg鎘致死率為2/3，300 mg/kg鎘致死率為3/3，給予常規鎘解毒劑200 mg/kg VC則能有效降低100 mg/kg鎘的致死率。而給予100、200 mg/kg化香樹果序和黃連素以及200 mg/kg油酸，同樣也能顯著降低100 mg/kg鎘致死率。鎘對小鼠的半致死劑量范圍往高劑量偏移。為了進一步證實該結果，在30～100 mg/kg及100～300 mg/kg范圍內各重新選定4個劑量進行試驗。

2.2? ? LD50測定試驗

基于2.1的結果，進一步探索在油酸、黃連素、化香樹果序等潛在鎘毒緩解藥物下的鎘半致死劑量LD50。結果如表3、4、5 所示。可以看出，對照組的鎘經口半致死劑量在140～160 mg/kg之間。給予常規解毒劑200 mg/kg VC，其鎘半致死劑量則上升至280～300 mg/kg。而給予100 mg/kg油酸后，鎘半致死劑量上升至260～280 mg/kg;給予200 mg/kg油酸后，鎘半致死劑量上升至300～320 mg/kg;給予其他集中鎘毒緩解藥物，鎘半致死劑量均有不同程度的上升。在這幾類潛在的鎘毒緩解藥物中，黃連素的緩解效果最優，給予200 mg/kg黃連素時，鎘半致死劑量上升至320～340 mg/kg。

3? ? 討論

相對于霍恩氏法和孫瑞元改良的寇氏法，以Lorke法為基礎的LD50分析方法能夠方便快捷地探索出毒物半致死劑量區間，并且能夠較準確地評價各聯合用藥的減毒效果。在第1次試驗中，以鎘的半致死劑量近似值100 mg/kg為中間值[12]，以1/3 LD50近似值30 mg/kg和3倍LD50 300mg/kg分別為毒性評價低值和高值進行分組，各組3只，這與改良的寇氏法的各組劑量按等比級數、各組動物數相等的原則基本相同，不僅確保了第1次試驗較高的可信度，同時還能初步評價出該藥物減毒（LD50<100 mg/kg）或增效（LD50>100 mg/kg）作用。并針對原Lorke法探索鎘等毒物存在劑量跨度較大，導致半致死劑量精確度較低等問題[10]，細化二次試驗所用劑量數，將原有的單一范圍4個劑量擴展到2個范圍8個劑量，可精確地反映出各抗鎘藥物劑量-效應關系。同樣考慮到盡可能減少動物使用數量及精確度，每組單一小鼠的分配原則還是能夠提供許多重要的有益數據。

在灌胃氯化鎘的同時，給予小鼠100～200 mg/kg的油酸、化香樹果序、黃連素能夠不同程度地降低鎘的毒性，提高小鼠鎘的半致死劑量。相對于由未灌胃任何抗鎘藥物的對照組，灌胃油酸組小鼠的鎘半致死劑量由140～160 mg/kg升至 300～320 mg/kg，其原因可能是油酸有效降低了鎘的蓄積及鎘造成氧化脅迫，降低鎘對小鼠的毒性效應[13]。而降低鎘水平也被認為是有效抗鎘減毒的重要方法[14]。灌胃化香樹果序與黃連素同樣能夠降低鎘造成的毒性效應，雖然目前尚未有報道證實兩者具有抗鎘作用，但化香樹果序多糖被證實清除DPPH、超氧自由基、羥基自由基，具備顯著的抗氧化能力[15];而黃連素也被證實能夠降低脂質過氧化、蛋白氧化，具有強抗氧化活性[16]。結合結果及相關報道，證實了基于Lorke法評價油酸、化香樹果序及黃連素抗鎘減毒活性的方法具有一定的應用價值。

4? ?參考文獻

[1] YUE Shiqiu，WANG Junran，ZOU Jinhua，et al.Cadmium localization and its toxic effects on root tips of barley[J].Zemdirbyste-agriculture，2016，103（2）：151-158.

[2] STAFFORD A D，ALAN S P，PARAMSOTHY J，et al.Soil cadmium and New Zealand dairy farms：impact of whole-farm contaminant variability on environmental management[J].Agriculture Ecosystems & Environment，2018，254：282-291.

[3] ZUGRAVU C A，PARVU M，PATRASCU D，et al.Cadmium pollution of some animal origin foods from Brasov and Dambovita County[J].Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca.Agriculture，2008，65（2）：453-458.

[4] ZHANG Runxiang，WANG Lisha，ZHAO Jianing，et al.Effects of selen-ium and cadmium on ion profiles in the brains of chickens[J].Biological Trace Element Research，2016，174（1）：1-8.

[5] RAGHUVANSHI R，CHAUDHARI A，KUMAR G N.Amelioration of cadmium-and mercury-induced liver and Kidney damage in rats by genetically engineered probiotic Escherichia coli Nissle 1917 producing pyrroloquinoline quinone with oral supplementation of citric acid[J].Nut-rition，2016，32（11/12）：1285-1294.

[6] SHI L，CAO H，LUO J，et al.Effects of molybdenum and cadmium on the oxidative damage and kidney apoptosis in Duck[J].Ecotoxicol Environ Saf，2017，145：24-31.

[7] 楊自軍.鎘的污染及對動物的危害與防治[J].中國動物保健，2008（5）：55-60.

[8] 陳爽，侯振中，管延杰，等.亞硒酸鈉對小鼠的半數致死量測定[J].東北農業大學學報，2012，43（3）：91-94.

[9] 沈潔，謝海棠，孫瑞元.定量藥理學：一個促進藥物開發及轉換型研究嚴謹思考的多學科領域[J].中國臨床藥理學與治療學，2008，13（5）：481-493.

[10] DIETRICH L.A new approach to practical acute toxicity testing[J].Arch-ives of Toxicology，1983，54（4）：275-287.

[11] 王靖雯，陳澤娜，高健，等.油酸對小鼠急性鎘中毒的緩解作用及鎘殘留的影響[J].生物學雜志，2018，8（24）：1-6.

[12] 劉莉莉，林嵐，殷霄，等.鎘毒性研究進展[J].中國職業醫學，2012，39（5）：445-447.

[13] WANG Jingwen，ZHANG? Yuanyuan，FANG Zhijia，et al.Oleic acid all-eviates cadmium-induced oxidative damage in rat by its radicals scave-nging activity[J].Biological Trace Element Research，2018，18：1-6.

[14] 陳美先.無機型離子交換樹脂驅除幾種中成藥中超標鉛鎘汞砷的研究[D].鄭州：河南大學，2016.

[15] 陳易彬，張益，陳奎.化香樹果序多糖抗氧化性[J].食品科技，2010，35（2）：141-143.

[16] ZHANG Benjian，XU Dan，GUO Yu，et al.Protection by and anti-oxida-nt mechanism of berberine against rat liver fibrosis induced by multiple hepatotoxic factors[J].Clinical & Experimental Pharmacology & Physio-logy，2008，35（3）：303-309.

基金項目? ?國家自然科學基金（31701706）;廣東省高等學校創新強校項目（GDOU2019040203）。

作者簡介? ?房志家（1986-），男，湖南桂陽人，博士，講師。研究方向：食品質量與安全。

*通信作者

收稿日期? ?2019-01-08