ERCC1、TS及MS狀態在老年Ⅲ、Ⅳ期胃癌新輔助化療中的變化及意義

馮斌 姜雷 張晴 惠麗娜 常靜 范開席 趙春紅

(1山東省醫學科學院附屬醫院腫瘤內科，山東 濟南 250031；2日照市人民醫院神經外科；山東省醫學科學院附屬醫院 3放射科；4中心實驗室)

核苷酸切除修復交叉互補基因(ERCC)1、胸苷酸合成酶(TS)及微衛星不穩定性(MSI)廣泛存在于胃癌組織中，并與患者預后及化療療效有關，其中，ERCC1與鉑類耐藥有關，TS與氟尿嘧啶(FU)類耐藥有關。錯配修復(MMR)基因(PMS2、MLH1、MSH2、MSH6)及微衛星(MS)狀態則在胃癌中尚無確切研究。本研究旨在探討老年胃癌患者化療前后ERCC1、TS及MS狀態的變化及與化療療效的關系。

1 資料和方法

1.1一般資料 2013年11月至2016年11月在我院就診的66例60歲以上Ⅲ、Ⅳ期局部晚期胃癌患者，男37例,女29例,年齡60～79〔平均(66.5±5.3)〕歲。術前給予4～8個周期轉化治療，平均(5.0±1.0)個周期。分化程度：高分化2例，中分化39例，低分化25例。納入標準：①初診且有胃鏡活檢組織標本，病理組織學證實為胃癌；②應用FOLFOX6方案新輔助化療成功，能夠接受手術治療；③組織標本符合免疫組化檢測的要求。排除標準：①胃鏡活檢前曾做過放療、化療；②新輔助化療不成功；③肝腎、心、肺功能不全者。用免疫組化法檢測ERCC1、TS及MMR蛋白(PMS2、MLH1、MSH2、MSH6)表達水平。病理診斷結果由兩名以上病理醫生確認。

1.2轉化治療方法 患者術前給予FOLFOX6方案進行轉化治療。第1天：奧沙利鉑100 mg/m2靜脈輸注2 h， 亞葉酸鈣400 mg/m2靜脈輸注2 h；氟尿嘧啶400 mg/m2靜脈推注，然后2 400～3 000 mg/m2，持續靜脈輸注46 h； 每2 w重復1次。連用4～8個周期后，視病情緩解程度選擇手術時機。

1.3實驗方法 ①TS、ERCC1檢測：常規脫蠟、乙醇梯度水化，枸櫞酸鹽抗原熱修復，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，37℃10 min，滴加一抗(TS、ERCC1，1∶50)，4℃過夜，滴加聚合物增強劑(試劑A)，室溫下孵育20 min，后再滴加酶標抗鼠/兔聚合物(試劑B)，室溫下孵育30 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色3～10 min，蘇木素復染、脫水、透明。中性樹膠封片后鏡下觀察，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，用已知的陽性片做陽性對照(所有試劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司)。在顯微鏡下觀察，以細胞質出現棕黃色顆粒染色為陽性表達。②MS狀態檢測：常規脫蠟，PBS清洗3次，3 min/次。切片經30%過氧化氫-甲醇混合液浸泡10 min后，放入加有檸檬酸鈉的染缸，煮沸10 min，自然恢復至室溫。PBS洗滌后將兔抗人MLH1、MSH2、MSH6及PMS2按1∶300稀釋，每張組織切片滴50 μl，將切片置于濕盒放入4℃冰箱過夜后，室溫平衡30 min，用PBS緩沖液洗滌3次，每次10 min，二抗于組織上，放于濕盒室溫溫育30 min。用辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素及DAB染色30 min，水洗吹干后，用樹脂封片〔1〕(所有試劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司)。在顯微鏡下觀察，以細胞核出現棕黃色顆粒染色為陽性表達，若腫瘤組織陰性表達而正常黏膜陽性表達，表示有缺失，提示突變。MLH1、MSH2、MSH6或PMS2中任何一個基因蛋白的表達缺失，即認為MSI腫瘤，否則即為微衛星穩定(MSS)。

1.4病理化療反應評估 按照美國國立綜合癌癥網絡指南中新輔助治療后的病理學評估標準分為：0(完全緩解)無癌細胞；1(部分緩解)單個或小灶狀癌細胞殘留；2(療效小)殘留癌灶版纖維增生；3(療效差)療效微小或無療效；廣泛殘余癌細胞。在本研究中，0～2定為有反應組，3為無反應組。

1.5統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行χ2檢驗、Fisher確切概率檢驗、McNemar檢驗、二元Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1轉化治療的病理化療反應 病理化療反應評估顯示，化療反應0、1、2、3者分別為：0(0.0%)、13(19.7%)、37(56.1%)、16(24.2%)。有反應組50例(75.8%)，無反應組16例(24.2%)。

2.2化療前各指標與新輔助化療療效的關系 不同TS、ERCC1、臨床分期、分化程度的胃癌患者化療反應差異均無統計學意義(P>0.05)，MSS患者和男性患者分別有較好的化療療效(P<0.01,P<0.05)。見表1。

表1 化療前各指標與新輔助化療療效的關系(n)

1)Fisher確切概率檢驗

2.3TS、ERCC1、MS狀態在化療前后的變化 TS和 ERCC1在化療后表達率下降(P<0.001,P=0.024)，MS狀態在化療前后的變化無統計學差異(P>0.05)，見表2、3；分別以化療反應、分化程度、分期、性別為分層因素進行TS、ERCC1和MS狀態在化療前后變化的分析，TS在化療有效組、高-中分化組、Ⅲ期、Ⅳ期、女性患者中表達率下降(P<0.05,P<0.01)；ERCC1在化療有效組、女性患者中表達率下降(P<0.05)；MS狀態在各分層因素中無明顯變化(P>0.05)，見表4。

2.4與新輔助化療療效相關的多因素Logistic回歸分析結果 以新輔助化療療效為因變量，化療前TS、ERCC1、MS狀態、性別、臨床分期和分化程度作為自變量，進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，性別是影響新輔助化療療效的危險因素，相對于男性，女性療效相對較差，OR=0.164，95%CI為0.031～0.864，P=0.033。

表2 化療前后TS、ERCC1表達的變化(n)

表3 化療前后MS狀態表達的變化(n)

表4 MS狀態、TS、ERCC1在新輔助化療前后的分層分析(n)

3 討 論

胃癌是常見的惡性腫瘤，在中國，胃癌的發病率占惡性腫瘤的第2位，2003～2007 年全國胃癌發病率為33.14/10 萬〔2〕。胃癌又是一個腫瘤異質性疾病，即使在相同的病理分期、臨床表現，其治療結果和預后均有顯著的差異。圍繞胃癌的基因研究很多，早年報道多集中在ERCC1和TS對胃癌化療的影響上。ERCC1定位于19號染色體上,是核苷酸切除修復(NER)活性的標志性基因。NER是修復DNA損傷的最主要途徑,也是修復草酸鉑所致的DNA損傷的最主要途徑。Fareed等〔3〕對142例胃食管結合部腫瘤的患者用以鉑類為基礎的新輔助化療，觀察ERCC1的表達與腫瘤退縮率(TRG)和無進展生存期(DFS)、總生存期(OS)等的關系，發現ERCC1高表達和低TRG、低DFS、低OS有關。Hirakawa等〔4〕對43例局部晚期可切除胃癌患者進行多西他賽和順鉑、替吉奧(S1)聯合新輔助化療，檢測化療后ERCC1表達和化療療效的關系，發現ERCC1高表達對化療抵抗率為82.5%。TS是胸苷酸合成的限速酶,過表達將誘發腫瘤細胞對5-FU產生耐藥,因此,TS 是5-FU化療敏感性的標志基因。張丹等〔5〕通過研究晚期胃癌患者應用S1化療后TS和療效的關系，發現外周血TS mRNA表達水平與晚期胃癌患者S1化療療效呈負相關性，其水平越高，化療有效率越低，患者生存時間越短，反之亦然。Chen等〔6〕對胃癌患者應用FLEEOX方案治療前后均進行了ERCC1和TS表達情況的檢測，通過與患者的療效分析，發現低ERCC1/TS表達者有更好的化療效果。王維民等〔7〕也對ERCC1和TS與胃癌術后化療療效進行了研究，發現ERCC1和TS陽性表達者術后輔助化療預后差。但在老年胃癌中，尤其在新輔助化療方面，缺乏相關的研究。本研究說明老年女性胃癌患者化療可降低ERCC1和TS的表達。TS在高-中分化組及Ⅲ期患者中有顯著性降低，而ERCC1不受分化程度及分期的影響。

MMR具有修復DNA堿基對錯配的功能，有利于DNA復制維持高保真性，維持基因組的穩定性和降低自發性突變等。該系統任一基因突變，都會導致細胞MMR功能缺陷，結果產生遺傳不穩定，表現為復制錯誤或MS不穩定，因而容易發生腫瘤。MSI狀態在結直腸癌的研究中基本已經明確，可作為術后輔助化療的療效預測及預后因子，MMR基因表達異常導致的MSI不僅是Ⅱ期結直腸癌預后良好的一個指標，而且也是對FU類藥物不敏感的一個預測因素。但在胃癌中相關研究并未明確。Bae等〔8〕分析了464例進展期胃癌患者，發現高度微MSI(MSI-H)和高齡、女性、遠端位置、大腫塊、腸型有關，多因素分析顯示MSI-H是進展期胃癌一個獨立的擁有良好OS的因素。Karpińska-Kaczmarczyk等〔9〕對波蘭胃癌患者進行了分析，MSI-H發生率為5.6%，和胃癌的Lauren分型有關，和世界衛生組織分類中管狀和乳頭狀分型有關，和年齡、性別、腫瘤位置、侵犯深度、淋巴結狀態、是否存在潰瘍及淋巴細胞浸潤無關。孫曉衛等〔10〕對胃癌患者行FU/ 醛氫葉酸新輔助化療，檢測化療前后MSI狀態的變化，發現新輔助化療后部分MSI 陽性的病例可以表現為陰性,但對MSI 陰性病例無影響。本研究說明MSI是老年Ⅲ、Ⅳ期胃癌新輔助化療療效的一個預測指標。是否新輔助化療對MS狀態有影響，研究發現，新輔助治療后MSH6缺失可以顯著增加，推測該現象可能與新輔助治療導致MSH6發生繼發突變或腫瘤細胞在缺氧環境下下調了MSH6的表達有關〔11〕。本研究中并沒有得到陽性結果，僅有MSI發生增加的趨勢。

本研究關于TS、ERCC1和MS狀態對Ⅲ、Ⅳ期結直腸癌患者新輔助化療療效影響的結果，由于既往研究中多數并未得出陽性結論，本次研究結果是否與樣本量太少導致結果有所偏差需進一步擴大樣本量驗證。

本研究中還顯示男性有更好的化療療效，復習了以往的相關文獻，僅在Bae等〔8〕進行的一項關于胃癌中進行MS檢測中發現，MSI-H和女性有關。本研究中MS狀態在男女性別中的差異并沒有統計學意義。是否男性療效好與男性體質好、化療承受力更強有關，還是由于樣本量太少導致結果偏差有關，均需擴大樣本進一步研究。

TS、ERCC1和MMR蛋白對老年中晚期胃癌的預測及預后作用尚未明確。本研究說明MS狀態是老年Ⅲ、Ⅳ期胃癌新輔助化療療效的一個預測指標。活檢標本和化療后的手術標本中TS、ERCC1和MS狀態表達水平存在不一致性，是否應以手術后標本的檢測結果來指導術后治療需進一步研究。